本文選題：HCC　切入點(diǎn)：超聲微泡　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：(一)靶向載多西紫杉醇脂質(zhì)微泡的制備及性質(zhì)測(cè)定目的:制備靶向載多西紫杉醇微泡,連接腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的CD105單克隆抗體。方法:本研究采用改良薄膜水化、機(jī)械振蕩法制備載多西杉醇脂質(zhì)超聲微泡(Docetaxel Loaded Lipid Microbubble,DLLM)。通過生物素-鏈親和素連接載藥脂質(zhì)體微泡(DLLM)以及CD105單克隆抗體,得到靶向載多西紫杉醇微泡(CD105-DLLM)。隨后進(jìn)行了以下性質(zhì)測(cè)定:1.靶向載多西紫杉醇微泡特征和性質(zhì)測(cè)定:凍干機(jī)凍干后,掃描電鏡(SEM)下觀察;采用粒度分析儀測(cè)量微泡粒徑,將微泡按一定比例稀釋,水浴超聲分散30 min,測(cè)量微泡粒徑;2.CD105-DLLM包封率和載藥量測(cè)定:使用反相高效液相色譜(HPLC)法檢測(cè)包封率、載藥量;3.CD105-DLLM的體外釋藥測(cè)定:通過制備模擬體液,將CD105-DLLM裝入透析袋,分為UTMD(Ultrasound Targeted Microbubble Destruction,超聲靶向微泡破壞技術(shù))組、自然釋放組,進(jìn)行體外釋藥測(cè)定,濃度由HPLC法測(cè)得;4.CD105-DLLM穩(wěn)定性初步考察:將新鮮制備的CD105-DLLM凍干后,分別保存在冷藏(2-8℃)或常溫環(huán)境下,之后每日取少量微泡,并觀察微泡并照片,同時(shí)檢測(cè)包封率和載藥量。結(jié)果:1.一般形態(tài)觀察:掃描電鏡(SEM)下,CD105-DLLM形態(tài)規(guī)則,外形圓整,分散好,未見明顯粘連,粒徑分布均勻。平均粒徑:3220±1570 nm。2.HPLC法測(cè)定CD105-DLLM包封率及載藥量:測(cè)得包封率為80-86.5%,載藥量18.5-23%。3.穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果:4℃下存放微泡為適宜溫度,微泡宜新鮮制備。4.HPLC法測(cè)得在48h內(nèi),CD105-DLLM+UTMD組在超聲爆破后得以完全釋放,藥物釋放率達(dá)到100%,達(dá)到快速釋放的目的。結(jié)論:本部分實(shí)驗(yàn)制備了一種靶向微泡-將多西紫杉醇包封于脂質(zhì)體中并連接CD105抗體,制備了穩(wěn)定性較好,包封率、載藥量均較高的CD105-DLLM,還能在UTMD介導(dǎo)下能夠達(dá)到快速釋放的目的。(二)UTMD介導(dǎo)下靶向載多西紫杉醇脂質(zhì)體微泡(CD105-DLLM)對(duì)人肝癌細(xì)胞MHCC-H的增殖抑制作用及靶向能力測(cè)定目的:通過體外細(xì)胞及荷瘤動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn),探討由CD105單克隆抗體標(biāo)記的載多西紫杉醇脂質(zhì)體微泡(CD105-DLLM+UTMD)對(duì)人肝癌細(xì)胞MHCC-H的靶向能力;通過離體(細(xì)胞)及在體(動(dòng)物)實(shí)驗(yàn),明確CD105-DLLM+UTMD對(duì)人肝癌細(xì)胞MHCC-H的增殖抑制效果。方法:體外培育MHCC-H肝癌細(xì)胞系。細(xì)胞培養(yǎng)條件:37℃、5%CO2、飽和濕度,含10%胎牛血清的DMEM-HG培養(yǎng),隔日換液,90%融合時(shí)傳代。待細(xì)胞生長狀態(tài)穩(wěn)定時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),分為四組:Control,DOC,DLLM,CD105-DLLM+UTMD。對(duì)不同組別細(xì)胞分別進(jìn)行以下測(cè)定:1.CD105-DLLM體外尋靶實(shí)驗(yàn):分別使用Cy3-PEG-Biotin標(biāo)記CD105-DLLM、DLLM,選取處于對(duì)數(shù)生長期的MHCC-H細(xì)胞,置于6孔板中爬片生長后染色后,激光共聚焦顯微鏡(LSCM)下觀察微泡對(duì)肝癌細(xì)胞的體外靶向能力,用IPP7.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)。2.體外細(xì)胞活力、增殖抑制實(shí)驗(yàn)。用CCK-8法檢測(cè)四組不同方式對(duì)人肝癌細(xì)胞MHCC-H增殖抑制作用,具體包括:(1)通過CCK-8法測(cè)定不同處理方式對(duì)人肝癌細(xì)胞MHCC-H細(xì)胞活力的影響;(2)通過CCK-8法測(cè)定不同處理方式對(duì)人肝癌細(xì)胞MHCC-H增殖的作用。3.荷瘤裸鼠體內(nèi)CD105-DLLM尋靶實(shí)驗(yàn):采用快速種植法建立荷瘤裸鼠模型。建模成功后,分別向裸鼠尾靜脈注入Cy-3標(biāo)記CD105-DLLM后給予UTMD和Cy3標(biāo)記的DLLM;將麻醉好的荷瘤裸鼠置于小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)臺(tái)內(nèi),檢測(cè)Cy-3染料標(biāo)記CD105-DLLM在荷瘤裸鼠體內(nèi)發(fā)光情況;(2)觀察不同處理方式對(duì)荷瘤裸鼠生存時(shí)間的影響,繪制生存曲線圖;(3)檢測(cè)、觀察不同組別中荷瘤裸鼠腫瘤生長的影響,并用超聲二維成像、小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)對(duì)裸鼠體內(nèi)CD105-DLLM聯(lián)合UTMD后的情況進(jìn)行圖像采集、分析。結(jié)果:1.體外細(xì)胞活力結(jié)果顯示:CD105-DLLM+UTMD組在4h后其細(xì)胞活力的抑制作用顯著強(qiáng)于其它各組(P0.01);2.細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:CD105-DLLM+UTMD組在各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)對(duì)人肝癌細(xì)胞MHCC-H的增殖抑制作用均明顯高于其它各組(P0.01)。3.通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察到CD105 DLLM在體外具備良好的靶向性。4.荷瘤裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn):(1)HE染色結(jié)果示成功建立MHCC-H荷瘤裸鼠模型;(2)體內(nèi)動(dòng)物尋靶能力測(cè)定結(jié)果:小動(dòng)物活體熒光成像發(fā)現(xiàn),CD105-DLLM組可檢測(cè)到紅色熒光聚集于腫瘤部位,而Control組無法檢測(cè)到區(qū)別于背景的紅色熒光區(qū)域,證實(shí)了CD105-DLLM在荷瘤裸鼠體內(nèi)也具有良好的靶向性;(3)對(duì)各組的荷瘤裸鼠進(jìn)行了生存曲線對(duì)比。結(jié)果顯示,CD105-DLLM+UTMD組裸鼠較Control組相比,生存時(shí)間明顯延長。(4)超聲二維圖示CD105-DLLM+UTMD組裸鼠腫瘤體積相對(duì)Control組,腫瘤體積明顯減小。結(jié)論:1.CD105-DLLM+UTMD能夠降低人肝癌細(xì)胞MHCC-H細(xì)胞活力;2.CD105-DLLM+UTMD對(duì)MHCC-H細(xì)胞具有增殖抑制作用;3.CD105-DLLM在體外(細(xì)胞)、體內(nèi)(荷瘤裸鼠)均具備靶向能力。(三)UTMD介導(dǎo)下CD105-DLLM對(duì)人肝癌細(xì)胞MHCC-H增殖抑制、凋亡的作用機(jī)制目的:探討UTMD下的CD105-DLLM對(duì)于人肝癌細(xì)胞MHCC-H的作用,研究其細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、凋亡相關(guān)蛋白的影響,探索凋亡相關(guān)機(jī)制。方法:將對(duì)數(shù)生長期MHCC-H細(xì)胞分為四組:空白微泡(CON),單純多西紫杉醇(DOC),載多西紫杉醇微泡(DLLM),靶向載多西紫杉醇脂質(zhì)微泡并以超聲爆破(CD105-DLLM+UTMD)組:1.用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期、凋亡周期;2.用TUNEL檢測(cè)各組MHCC-H細(xì)胞的凋亡,用IPP7.0軟件選取凋亡細(xì)胞,計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比;3.Western blotting檢測(cè)各組凋亡相關(guān)蛋白Bax,Bcl-2,Cyto-c,P53,Caspase-3表達(dá)的變化、蛋白含量;4.激光共聚焦顯微鏡(LSCM)下觀察人肝癌MHCC-H活細(xì)胞中Caspase-3含量及細(xì)胞形態(tài)變化。結(jié)果:1.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:CD105-DLLM+UTMD顯著抑制分裂期細(xì)胞比例。CD105-DLLM聯(lián)合超聲靶向釋藥顯著抑制肝癌細(xì)胞MHCC-H分裂期細(xì)胞比例,能在抑制肝癌細(xì)胞增殖的同時(shí)顯著增加MHCC-H細(xì)胞凋亡率;2.TUNEL原位凋亡檢測(cè)顯示CD105-DLLM誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞MHCC-H凋亡;3.CD105-DLLM+UTMD組中,Cyt-c、Bax/Bcl-2、P53的表達(dá)均顯著高于其他各組(P均0.01),而在Caspase3的激活實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)DOC組及CD105-DLLM+UTMD組均可引起Caspase 3的大量激活,以CD105-DLLM+UTMD引起的Caspase-3數(shù)量更為顯著。4.通過LSCM觀察活細(xì)胞Caspase-3的含量,在5h內(nèi)細(xì)胞核中可見Caspase 3激活產(chǎn)生的綠色團(tuán)塊(凋亡細(xì)胞)出現(xiàn)并逐漸增多,而細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞形態(tài)無變化;5h后細(xì)胞核內(nèi)綠色團(tuán)塊繼續(xù)增加、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)逐步出現(xiàn)綠色凋亡小體;在作用10h后,CD105-DLLM+UTMD組出現(xiàn)了明顯的Caspase-3移位,多數(shù)激活的Caspase-3轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜表面。結(jié)論:在該試驗(yàn)條件下,UTMD介導(dǎo)的CD105-DLLM可通過抑制增值期細(xì)胞比例來抑制肝癌細(xì)胞增殖,同時(shí)激活了凋亡同路并誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞MHCC-H發(fā)生凋亡、引起了Caspase-3激活及移位,從而發(fā)揮其腫瘤抑制作用。小結(jié):本實(shí)驗(yàn)將多西紫杉醇包封于脂質(zhì)體中并連接CD105抗體,制備了穩(wěn)定性較好,包封率、載藥量均較高,在UTMD介導(dǎo)下能夠快速釋放的靶向載藥脂質(zhì)超聲微泡。通過對(duì)各組人肝癌細(xì)胞MHCC-H的細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖水平的測(cè)定發(fā)現(xiàn):CD105-DLLM+UTMD能夠明顯降低MHCC-H細(xì)胞活力、對(duì)MHCC-H細(xì)胞具有增殖抑制作用;通過尋靶實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了CD105-DLLM在體外(細(xì)胞)、體內(nèi)(荷瘤裸鼠)均具備靶向能力;活細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示:由UTMD介導(dǎo)的CD105-DLLM引起了Caspase3激活及移位、可誘導(dǎo)MHCC-H肝細(xì)胞發(fā)生凋亡,Western blotting檢測(cè)所示Cyto-c和Caspase-3在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7;R445.1

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本文編號(hào)：1673260