本文關(guān)鍵詞：MSH2基因、端粒酶及NADPH氧化酶與腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的相關(guān)研究

  更多相關(guān)文章： MSH2基因 碳離子束 輻射敏感性 DNA損傷修復(fù) NADPH氧化酶 端粒酶

【摘要】：目的:研究腫瘤細(xì)胞內(nèi)MSH2基因表達(dá)、端粒酶及NADPH氧化酶對輻射敏感性的影響并探討其作用機(jī)制。研究內(nèi)容包括四方面:第一,X射線及重離子輻照對人腫瘤細(xì)胞MSH2表達(dá)及生物學(xué)效應(yīng)的影響;第二,抑制MSH2表達(dá)提高人腫瘤細(xì)胞碳離子輻射敏感性;第三,MSH2下游基因hTERT對人腫瘤細(xì)胞重離子輻射敏感性的影響;第四,內(nèi)源性活性氧參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞重離子輻射敏感性。材料和方法:碳離子束和X射線輻照人肝癌HepG2細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞,應(yīng)用MTT實驗分別對輻照后細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測,采用克隆形成實驗檢測細(xì)胞存活率,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡,RT-PCR、Western Blotting、激光共聚焦顯微鏡檢測MSH2、端粒酶各亞基、PGC-1a、NOX家族蛋白的表達(dá);合成特異性MSH2-siRNA寡核苷酸,轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,抑制MSH2的表達(dá),觀察下調(diào)MSH2基因后肝癌HepG2細(xì)胞輻射敏感性的變化;用端粒酶抑制劑MST-312處理人乳腺癌MCF-7細(xì)胞,應(yīng)用相應(yīng)試劑盒檢測端粒酶活性,線粒體總量、線粒體DNA拷貝數(shù)量和線粒體膜電位及細(xì)胞衰老;利用NADPH氧化酶抑制劑diphenyliodonium(DPI)處理人肝癌HepG2細(xì)胞,應(yīng)用熒光探針DCFH-DA檢測活性氧水平,激光共聚焦顯微鏡觀察p47phox亞基與NOX2在細(xì)胞內(nèi)的分布及數(shù)量,分析重離子輻照后NADPH氧化酶在輻射敏感性中的作用。結(jié)果:第一,X射線和碳離子輻照人肝癌HepG2細(xì)胞后,隨輻射劑量增加存活率逐漸降低,存在劑量依賴性,并且高LET的碳離子明顯比X射線對人肝癌HepG2細(xì)胞的殺傷能力強(qiáng)。經(jīng)重離子輻照后,2 h便出現(xiàn)MSH2表達(dá),隨著時間延長,MSH2表達(dá)逐漸增加,至6 h時,這種修復(fù)作用似接近高峰,隨著時間的推移,MSH2的表達(dá)逐漸減小,在12 h時仍有表達(dá),但24 h幾乎看不到表達(dá),推測其行使DNA損傷修復(fù)功能的高峰可能在6 h-12 h。第二,轉(zhuǎn)染MSH2 siRNA后,MSH2表達(dá)下降,人肝癌HepG2細(xì)胞對重離子輻射敏感性提高,并出現(xiàn)G2/M期阻滯,隨后sub-G1明顯升高;隨劑量和時間延長,P53蛋白表達(dá)也逐漸增高。第三,人乳腺癌MCF-7細(xì)胞端粒酶活性在照射4 Gy、10 Gy受到抑制,比較照射前及照射后hTERT mRNA在輻照后表達(dá)下降,這一結(jié)果進(jìn)一步由real-time PCR在mRNA水平和Western Blotting在蛋白水平證實,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2μM hTERT抑制劑聯(lián)合2-4 Gy射線處理MCF-7后,克隆存活率與單獨(dú)輻照組明顯減少。在2 Gy照射時克隆存活率為46%,經(jīng)MST-312處理后,克隆存活率進(jìn)一步減少到17%。單獨(dú)用重離子輻照,可以使細(xì)胞在輻照24 h后出現(xiàn)G2/M期阻滯,48 h后有所下降,但仍高于對照組。隨著加入MST-312,G2/M向G1/S轉(zhuǎn)換;重離子輻射能夠顯著影響端粒酶活性,進(jìn)而抑制MCF-7線粒體的正常功能。并通過降低PGC-1a表達(dá)介導(dǎo)MCF-7的老化。第四,4 Gy重離子輻照HepG2細(xì)胞12 h后,細(xì)胞內(nèi)活性氧明顯增多,當(dāng)應(yīng)用DPI后,活性氧明顯減少。4 Gy重離子輻照HepG2細(xì)胞后,p47phox亞基明顯增多,給予抑制劑后p47phox亞單位明顯減少,并且NOX2的變化與p47phox亞單位一致。NOX家族的大部分蛋白,在重離子輻照1 h后明顯上升,并且存在劑量依賴性。NOX2、NOX3表達(dá)在4 Gy輻照后比1 Gy輻照后下降的多,說明在低劑量重離子輻射情況下也主要由NOX2,NOX3發(fā)揮功能。結(jié)論:第一,MSH2在射線損傷修復(fù)中起重要作用,下調(diào)MSH2的表達(dá)可以提高輻射敏感性,這一過程中p53信號通路起重要作用。第二,端粒酶抑制劑MST 312可以增強(qiáng)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7對重離子的輻射敏感性。第三,碳離子輻照可通過激活NADPH氧化酶產(chǎn)生ROS,從而增強(qiáng)重離子的輻射敏感性。
【關(guān)鍵詞】：MSH2基因 碳離子束 輻射敏感性 DNA損傷修復(fù) NADPH氧化酶 端粒酶
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院研究生院(近代物理研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.55
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-16
• 第一章 引言16-33
• 1.1 概述16-17
• 1.2 輻射敏感性的相關(guān)因素17-24
• 1.2.1 DNA的損傷與修復(fù)17-20
• 1.2.2 端粒及端粒酶20
• 1.2.3 抗氧化酶水平20-22
• 1.2.4 細(xì)胞周期調(diào)控22-23
• 1.2.5 細(xì)胞凋亡23
• 1.2.6 其它23-24
• 1.3 DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白24-28
• 1.3.1 同源重組途徑中主要蛋白24-25
• 1.3.2 非同源末端連接途徑中的主要蛋白25
• 1.3.3 參與同源重組途徑和非同源末端連接途徑的蛋白25
• 1.3.4 錯配修復(fù)家族蛋白25-28
• 1.4 錯配修復(fù)基因MSH2的結(jié)構(gòu)和功能28-32
• 1.4.1 MSH2的結(jié)構(gòu)28-29
• 1.4.2 MSH2在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)29
• 1.4.3 MSH2在DNA損傷修復(fù)中的作用29
• 1.4.4 MSH2在腫瘤細(xì)胞凋亡中的作用29-30
• 1.4.5 MSH2與端粒酶30-31
• 1.4.6 MSH2與ROS31-32
• 1.5 研究目的及意義32-33
• 第二章 X射線及重離子輻照對HepG2細(xì)胞MSH2表達(dá)及生物學(xué)效應(yīng)影響33-50
• 2.1 實驗?zāi)康?/span>33-34
• 2.2 實驗材料與方法34-40
• 2.2.1 實驗材料34
• 2.2.2 實驗方法和步驟34-40
• 2.3 實驗結(jié)果40-48
• 2.3.1 形態(tài)學(xué)變化40-42
• 2.3.2 細(xì)胞存活曲線42-44
• 2.3.3 細(xì)胞周期44-45
• 2.3.4 MSH2參與重離子輻照后肝癌HepG2細(xì)胞核中DNA損傷修復(fù)45-47
• 2.3.5 mRNA水平上MSH2表達(dá)的差異47
• 2.3.6 蛋白水平上MSH2表達(dá)的差異47-48
• 2.4 討論48-50
• 第三章 抑制MSH2表達(dá)提高HepG2細(xì)胞碳離子輻射敏感性50-65
• 3.1 實驗?zāi)康?/span>50-51
• 3.2 實驗材料與方法51-55
• 3.2.1 實驗材料51
• 3.2.2 寡核苷酸合成51
• 3.2.3 分組51-52
• 3.2.4 轉(zhuǎn)染52
• 3.2.5 siRNA抑制MSH2表達(dá)效果檢測52-53
• 3.2.6 Western Blotting檢測53
• 3.2.7 輻照53
• 3.2.8 周期檢測53
• 3.2.9 克隆存活檢測53-54
• 3.2.10 MTT檢測54
• 3.2.11 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡54
• 3.2.12 Western Blotting檢測凋亡蛋白54-55
• 3.2.13 統(tǒng)計學(xué)分析55
• 3.3 實驗結(jié)果55-64
• 3.3.1 realtime PCR檢測目的基因表達(dá)55-56
• 3.3.2 Western Blotting檢測目的基因的表達(dá)56-57
• 3.3.3 下調(diào)MSH2對HepG2細(xì)胞增殖及克隆形成能力的影響57-58
• 3.3.4 MSH2抑制后肝癌HepG2細(xì)胞對放射線的敏感性變化58-59
• 3.3.5 MSH2抑制后對肝癌HepG2細(xì)胞存活率的影響59-61
• 3.3.6 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的周期檢測61-62
• 3.3.7 MSH2抑制后細(xì)胞凋亡的變化62-63
• 3.3.8 p53信號通路的作用63-64
• 3.4 討論64-65
• 第四章 端粒酶活性通過線粒體影響癌細(xì)胞重離子輻射敏感性65-75
• 4.1 實驗?zāi)康?/span>65
• 4.2 實驗材料與方法65-69
• 4.2.1 實驗材料65-66
• 4.2.2 實驗方法66-69
• 4.3 實驗結(jié)果69-73
• 4.3.1 重離子輻射引起hTERT下調(diào)，端粒酶活性被抑制69
• 4.3.2 端粒酶抑制劑使人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞輻射性敏感性增加69-71
• 4.3.3 重離子在端粒酶抑制劑作用下細(xì)胞周期的再分布71
• 4.3.4 端粒酶活性及重離子輻射影響線粒體功能71-72
• 4.3.5 重離子輻射引起線粒體功能障礙介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞老化72-73
• 4.4 討論73-75
• 第五章 NADPH氧化酶與肝癌細(xì)胞HepG2重離子輻射敏感性關(guān)系75-82
• 5.1 實驗?zāi)康模?/span>75
• 5.2 實驗材料與方法75-77
• 5.2.1 主要材料75
• 5.2.2 主要試劑75-76
• 5.2.3 細(xì)胞輻照76
• 5.2.4 Western Blotting檢測76
• 5.2.5 活性氧檢測76-77
• 5.2.6 細(xì)胞生存分析77
• 5.2.7 激光共聚焦顯微鏡77
• 5.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析77
• 5.3.結(jié)果77-80
• 5.3.1 NADPH氧化酶參與重離子誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡77-78
• 5.3.2 NADPH氧化酶介導(dǎo)重離子輻射細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生78-79
• 5.3.3 ~(12)C~(6+) 誘導(dǎo)細(xì)胞膜p47~(phox)轉(zhuǎn)位激活NADPH氧化酶79
• 5.3.4 重離子上調(diào)NOX的表達(dá)79-80
• 5.4 討論80-82
• 第六章 結(jié)論與展望82-85
• 6.1 結(jié)論82
• 6.2 展望82-85
• 參考文獻(xiàn)85-99
• 縮寫詞表99-101
• 作者簡介及在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果101-102

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 肖國青;張紅;李強(qiáng);宋明濤;詹文龍;;中國科學(xué)院近代物理研究所重離子束治癌進(jìn)展[J];原子核物理評論;2007年02期

，

本文編號：1031097