本文關(guān)鍵詞：CD47及其相關(guān)信號(hào)通路在噬血細(xì)胞綜合征發(fā)病機(jī)制中的作用研究

  更多相關(guān)文章： 噬血細(xì)胞綜合癥 轉(zhuǎn)染方法 CD47 流式細(xì)胞術(shù) 發(fā)病機(jī)制 臨床特點(diǎn)

【摘要】：第一部分不同轉(zhuǎn)染方法對(duì)人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞Jurkat細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的比較 研究目的 從轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性兩方面探討不同轉(zhuǎn)染方法對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率的影響。 研究方法 1.細(xì)胞培養(yǎng)：用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Jurkat細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每2-3天進(jìn)行換液、傳代。 2.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法： 2.1HiperFect○R轉(zhuǎn)染試劑法： 取750ngsiRNA與12μlHiperfect○R轉(zhuǎn)染試劑形成轉(zhuǎn)染混合物，作用于Jurkat細(xì)胞24h后，用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞存活率，熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。 2.2InstantFECT○R轉(zhuǎn)染試劑法： 根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑與siRNA不同比分3組，分別為2μl轉(zhuǎn)染試劑+30pmolsiRNA、與2μl轉(zhuǎn)染試劑+60pmolsiRNA和3μl轉(zhuǎn)染試劑+90pmolsiRNA，將形成的轉(zhuǎn)染混合物作用于Jurkat細(xì)胞24h后，用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞存活率，熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。 3.NucleofectionTM○R電轉(zhuǎn)法 不同程序（CL-120、CM-137、CM-158、CM-189、CU-150和DG-150）刺激Jurkat細(xì)胞24h后，用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞存活率，熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。 結(jié)果 1.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染中，HiperFect○R轉(zhuǎn)染試劑法和InstantFECT○R轉(zhuǎn)染試劑法的細(xì)胞活性分別為（0.90±0.029）和（0.91±0.025），NucleofectionTM電轉(zhuǎn)法中CL-120、CM-137、CM-158、CM-189、CU-150和DG-150程序下細(xì)胞活性分別為（0.87±0.018）、（0.22±0.29）、（0.35±0.04）、（0.31±0.015）、（0.57±0.025）和（0.32±0.02）。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的兩種方法以及電轉(zhuǎn)中CL-120程序下，該3組間兩兩比較細(xì)胞活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 2.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染中，HiperFect○R轉(zhuǎn)染試劑法和InstantFECT○R轉(zhuǎn)染試劑法的轉(zhuǎn)染效率分別為（0.22±0.04）和（0.17±0.05），NucleofectionTM電轉(zhuǎn)法中CL-120、CM-137、CM-158、CM-189、CU-150和DG-150程序下轉(zhuǎn)染效率分別為（0.82±0.008）、（0.32±0.02）、（0.09±0.04）、（0.15±0.025）、（0.75±0.057）和（0.33±0.028）。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的兩種方法以及電轉(zhuǎn)中CL-120程序下，該3組間兩兩比較轉(zhuǎn)染效率差異有顯著性意義（P＜0.05） 結(jié)論 從轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性兩方面進(jìn)行評(píng)估，NucleofectionTM○R電轉(zhuǎn)法中的CL-120程序是一種轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞的新的安全，有效的轉(zhuǎn)染方法。 第二部分CD47在噬血細(xì)胞綜合征發(fā)病機(jī)制中的作用研究 研究?jī)?nèi)容 選用Jurkat細(xì)胞株和HLH患兒骨髓來源的巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象。利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段，改變細(xì)胞CD47的表達(dá)水平，觀察CD47的不同表達(dá)水平對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響。 研究方法 1.骨髓來源巨噬細(xì)胞的體外培養(yǎng)：從HLH患兒骨髓中提取單個(gè)核細(xì)胞，以M-CSF誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化，待巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)成功后，予IFN-γ和LPS刺激巨噬細(xì)胞向M1型分化，采用顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè)M1型巨噬細(xì)胞是否培養(yǎng)成功。 2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染法：詳見第一部分Nucleofection○R電轉(zhuǎn)法中CL-120程序。 3.流式細(xì)胞術(shù)： 3.1骨髓巨噬細(xì)胞培養(yǎng)鑒定，取不同時(shí)間（第5天，第8天）培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞，，用CD11b-APC、CD14-FITC和F4/80-PE標(biāo)記細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)鑒定巨噬細(xì)胞分化情況。 3.2取不同CD47siRNA轉(zhuǎn)染72h后得Jurkat細(xì)胞，CD47-FITC標(biāo)記細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞膜表面CD47的表達(dá)情況。 4.U937細(xì)胞的活化：取2×104個(gè)U937細(xì)胞，并用20ng/mlIFN-γ和10ng/mlLPS刺激48h，用PBS洗3次后，備用； 5.細(xì)胞體外吞噬功能的檢測(cè)： 取不同CD47表達(dá)情況的Jurkat細(xì)胞與活化的U937細(xì)胞或HLH患兒骨髓培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)2h，瑞士吉姆薩染色法檢測(cè)細(xì)胞吞噬率，吞噬率＝（2００個(gè)巨噬細(xì)胞中吞噬Jurkat細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)／2００個(gè)巨噬細(xì)胞）×１００％。 結(jié)果 1.巨噬細(xì)胞培養(yǎng)成功的鑒別方法：形態(tài)學(xué)方面，骨髓來源的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)M-CSF誘導(dǎo)后第7天出現(xiàn)了巨噬細(xì)胞的典型形態(tài)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)骨髓來源的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后有（91.4±4.7）%細(xì)胞表達(dá)CD11b和F4/80；用20ng/mlIFN-γ和10ng/mlLPS刺激培養(yǎng)成功的巨噬細(xì)胞48h，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形，偽足較細(xì)長(zhǎng)，為M1型巨噬細(xì)胞的典型形態(tài)，說明巨噬細(xì)胞培養(yǎng)成功。 2.流式細(xì)胞術(shù)比較轉(zhuǎn)染不同si-CD4724h、48h、72h后細(xì)胞膜CD47表達(dá)，結(jié)果顯示以si-CD47-3的抑制效果最好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；比較轉(zhuǎn)染后24h、48h以及72h的CD47表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)以轉(zhuǎn)染后48h抑制效果最佳，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）； 3.以活化的U937細(xì)胞為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)si-CD47-1、si-CD47-2和si-CD47-3組巨噬細(xì)胞的吞噬率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05））。將CD47的表達(dá)水平與細(xì)胞吞噬率做相關(guān)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD47表達(dá)水平與吞噬率呈負(fù)相關(guān)（r=-0.925，p=0.001） 4.以HLH患兒和急性白血�。ˋL）患兒骨髓來源的巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜上CD47的表達(dá)水平與巨噬細(xì)胞的吞噬作用成反比，即CD47的表達(dá)越低，巨噬細(xì)胞的吞噬作用越明顯，并且與巨噬細(xì)胞的來源無關(guān)。在同一水平表達(dá)的的CD47，與對(duì)照組白血病患兒相比，HLH患兒骨髓來源的巨噬細(xì)胞的吞噬率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 1.建立穩(wěn)定的體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞體系； 2.不同位點(diǎn)的siRNA對(duì)CD47基因的抑制作用不同，以si-CD47-3的抑制效果最好；在轉(zhuǎn)染CD47siRNA不同時(shí)間中，以轉(zhuǎn)染后48h抑制效果最佳； 3.以活化的U937細(xì)胞和HLH患兒骨髓來源的巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)CD47的表達(dá)水平與細(xì)胞吞噬率呈負(fù)相關(guān)，與巨噬細(xì)胞的來源無關(guān)。 第三部分噬血細(xì)胞綜合征臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查特點(diǎn)分析 研究?jī)?nèi)容 選用臨床資料作為研究對(duì)象，探討HLH相關(guān)臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)變化特點(diǎn)，評(píng)估HLH的早期診斷指標(biāo)以及預(yù)后不良因素。 研究方法 采用回顧分析法對(duì)比分析好轉(zhuǎn)病例、死亡病例的臨床、實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn)及治療因素。 結(jié)果 1.將19例HLH患兒中分為好轉(zhuǎn)組8例和死亡組11例，兩組之間的熱程、熱峰、淋巴結(jié)腫大以及肝脾腫大的大小無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）； 2.實(shí)驗(yàn)室檢查：比較死亡組與好轉(zhuǎn)組之間的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢查，發(fā)現(xiàn)血象降低程度（P=0.033）、凝血功能異常（P=0.020）以及凝血酶原時(shí)間（PT）異常（P=0.001）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；異型淋巴細(xì)胞；活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT）、LDH、ALT、AST、IgG、IgA、IgM和β2微球蛋白、SF水平、EBV-DNA負(fù)載量、EBV抗體譜以及骨髓中找到噬血細(xì)胞在兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 3.SF動(dòng)態(tài)變化：8例好轉(zhuǎn)HLH患兒隨著病情緩解，SF也隨之下降，11例死亡患兒中10例患兒隨病情進(jìn)展，SF隨之升高，其中1例患兒隨病情進(jìn)展SF下降，該患兒發(fā)病以神經(jīng)系統(tǒng)受累為首發(fā)癥狀。 4.將19例HLH患兒與52例傳染性單核細(xì)胞增多癥和重癥感染患兒用非參數(shù)假設(shè)下ROC曲線評(píng)價(jià)SF診斷HLH。SF的AUC為0.931，其中SF＞10000.00μg/L時(shí)，敏感度為22.22%，特異度為100.00%，SF＞3000.00μg/L時(shí)，敏感度為38.9%，特異度為100%，SF＞1000.00μg/L時(shí)，敏感度為83.33%，特異度為83.00%，SF＞500.00μg/L時(shí)，敏感度為100.00%，特異度為73.40%。 結(jié)論 1.血象降低的程度、纖維蛋白原降低的程度以及PT水平升高可能與預(yù)后不良有關(guān)。 2.SF＞3000μg/L時(shí)，可作為初步診斷HLH的可靠指標(biāo)。 3.血清SF越高，越具有診斷為HLH的價(jià)值，但SF水平與預(yù)后無關(guān)，其動(dòng)態(tài)變化可作為預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。
【關(guān)鍵詞】：噬血細(xì)胞綜合癥 轉(zhuǎn)染方法 CD47 流式細(xì)胞術(shù) 發(fā)病機(jī)制 臨床特點(diǎn)
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R725.5
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-14
• 前言14-17
• 第一部分 不同轉(zhuǎn)染方法對(duì)人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞Jurkat細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的比較17-26
• 研究?jī)?nèi)容17
• 主要材料和試劑17-18
• 研究方法和結(jié)果18-26
• (一) 研究方法18-21
• （二）結(jié)果21-26
• 第二部分 CD47 在噬血細(xì)胞綜合征發(fā)病機(jī)制中的作用研究26-36
• 1. 研究?jī)?nèi)容26
• 2. 主要材料和試劑26-28
• 研究方法和結(jié)果28-36
• 第三部分 噬血細(xì)胞綜合癥臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查特點(diǎn)分析36-45
• 1．研究對(duì)象和方法37-38
• 2. 結(jié)果38-42
• 3. 討論42-45
• 4. 結(jié)論45

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王小杰;王永為;曲銀娥;李欣;;siRNA轉(zhuǎn)染濃度和時(shí)間對(duì)HeLa細(xì)胞ANXA5表達(dá)的抑制作用[J];承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2014年01期

2 劉曉民,徐瑩,潘尚哈;猴免疫缺陷病毒外膜糖蛋白基因序列重組和突變克隆的轉(zhuǎn)染研究[J];哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2001年02期

3 郭敏;郎明健;曾秋棠;楊漢東;閔新文;;質(zhì)粒重組體在體轉(zhuǎn)染大鼠心肌的可行性[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2008年02期

4 胡占升;于學(xué)江;;重組血管生成素-Ⅰ基因在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染和表達(dá)[J];山東醫(yī)藥;2011年15期

5 豐貴文,于立新,趙顯國,張宏濤;脂質(zhì)體介導(dǎo)NF-κB decoy ODN低溫缺氧對(duì)ECV-304的轉(zhuǎn)染及復(fù)氧后對(duì)其黏附分子mRNA表達(dá)的影響[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2004年15期

6 張海江,韓世煒,桑建利,何大澄;MCF-7細(xì)胞瞬時(shí)基因表達(dá)轉(zhuǎn)染模式的建立[J];解剖學(xué)報(bào);2005年02期

7 陳紅;錢坤;張?zhí)K明;;不同轉(zhuǎn)染方法及GFP表達(dá)載體對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的比較[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2006年04期

8 王巍;張曉希;劉新光;;兩種常用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染siRNA至HL-60細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的比較[J];重慶醫(yī)學(xué);2011年04期

9 薛偉鋼;鼠IL-4在體內(nèi)顯示有效的抗腫瘤活性[J];國外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊(cè));1990年01期

10 周曉彤;沈振亞;于曙東;余云生;葉文學(xué);黃浩岳;焦鵬;滕小梅;;三種陽離子轉(zhuǎn)染試劑對(duì)小鼠血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞毒性的影響[J];江蘇醫(yī)藥;2008年03期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 周曉彤;;陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)小干擾RNA轉(zhuǎn)染EOMA細(xì)胞時(shí)轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化[A];第八屆華東六省一市胸心血管外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2005年

2 袁即山;利天增;祁少海;謝舉臨;徐盈斌;潘姝;張瓏娟;孔慶瑜;;人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞最佳轉(zhuǎn)染條件：α_1(Ⅰ)型前膠原基因反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)[A];第八屆全國燒傷外科學(xué)年會(huì)論文匯編[C];2007年

3 李士澤;張忠芳;張玉靜;;凋亡蛋白融合基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響[A];動(dòng)物生理生化學(xué)分會(huì)第八次學(xué)術(shù)會(huì)議暨全國反芻動(dòng)物營養(yǎng)生理生化第三次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要匯編[C];2004年

4 李幸;宮念樵;;不同轉(zhuǎn)染方法抑制DC分化過程中AXL基因表達(dá)的效率比較[A];2012中國器官移植大會(huì)論文匯編[C];2012年

5 潘俊杰;施海明;羅心平;李劍;梁旺;張進(jìn);馬端;;U937單核細(xì)胞轉(zhuǎn)染中幾種不同方法的比較[A];第十次中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)心血管病學(xué)術(shù)大會(huì)暨第五次江西省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)心血管病學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2010年

6 姚云清;張定鳳;黃愛龍;唐霓;王波;;乙型肝炎病毒DNA轉(zhuǎn)染與鴨乙型肝炎病毒感染原代鴨肝細(xì)胞對(duì)比研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國感染病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2001年

7 袁即山;利天增;祁少海;謝舉臨;徐盈斌;潘姝;張瓏娟;孔慶瑜;;α1(Ⅰ)型前膠原基因反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染人瘢痕成纖維細(xì)胞的條件優(yōu)化[A];第八屆全國燒傷外科學(xué)年會(huì)論文匯編[C];2007年

8 何星;李華;;三種轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)pGPU6/GFP/Neo真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞的比較研究[A];2013年全國激光醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)聯(lián)合會(huì)議暨2013年浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)整形美容學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2013年

9 趙詠梅;劉林;陳幸華;孔佩艷;彭賢貴;劉紅;王慶余;;小鼠TPO cDNA轉(zhuǎn)染前后骨髓基質(zhì)細(xì)胞TPOmRNA表達(dá)情況的研究[A];第10屆全國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要匯編[C];2005年

10 張橋;黃書文;鄢國平;;水溶性高分子保護(hù)的Lipofectamine 2000/DNA復(fù)合物的固相轉(zhuǎn)染研究[A];2012年全國高分子材料科學(xué)與工程研討會(huì)學(xué)術(shù)論文集（上冊(cè)）[C];2012年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 楊永新;陽離子聚磷腈衍生物的合成與修飾及其作為基因非病毒載體的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2008年

2 陳煒;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染Nkx2.5、GATA4、TBX5啟動(dòng)心肌細(xì)胞分化機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2012年

3 李暉;APOBEC3G轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2009年

4 侯旭暉;轉(zhuǎn)染siRNA特異性下調(diào)PAI基因表達(dá)抗血栓形成作用機(jī)制的研究[D];吉林大學(xué);2008年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 趙玉瑜;含羥基的陽離子聚合物的合成及其基因傳遞性能的研究[D];南京理工大學(xué);2013年

2 于建寧;脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染小鼠體細(xì)胞的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

3 陳穎;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染及其對(duì)腸瘺瘺口的影響[D];山東大學(xué);2010年

4 邵明斌;轉(zhuǎn)染外源性prohibitin在缺氧性腎小管上皮細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2012年

5 許勝貴;BMP-2慢病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨軟骨分化的研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2012年

6 壽奮勇;脂質(zhì)體介導(dǎo)的pIRES2-EGFP-NT-3轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2010年

7 張聞起;基于芳香共軛的兩親自組裝肽衍生物的設(shè)計(jì)、合成及其轉(zhuǎn)染能力研究[D];吉林大學(xué);2014年

8 董芳;Ad-GFP-NICD轉(zhuǎn)染對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞促動(dòng)脈形成潛能影響[D];蘭州大學(xué);2011年

9 夏波;CD47及其相關(guān)信號(hào)通路在噬血細(xì)胞綜合征發(fā)病機(jī)制中的作用研究[D];廣州醫(yī)科大學(xué);2014年

10 樊瓊;轉(zhuǎn)染窖蛋白1基因?qū)χ嗵钦T導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞Toll樣受體4表達(dá)的影響及大黃素的干預(yù)效應(yīng)[D];華中科技大學(xué);2013年

本文編號(hào)：943221