本文關(guān)鍵詞：SHH基因高甲基化在先天性肛門直腸畸形發(fā)病機(jī)制中的研究

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【摘要】：先天性肛門直腸畸形(anorectal malformations, ARM)是小兒最常見的消化道重大畸形,是世界衛(wèi)生組織常規(guī)監(jiān)測(cè)的先天畸形之一,我國(guó)發(fā)病率約為2.81/10000。雖然通過外科手術(shù)治療能夠糾治形態(tài)上的畸形,但有相當(dāng)部分患兒,尤其是中、高位畸形患兒,術(shù)后仍然存在不同程度的排便功能障礙如便失禁、污糞、便秘等,發(fā)生率高,直接影響著患兒術(shù)后的生活質(zhì)量。由于先天性ARM發(fā)病因素多樣及病理改變復(fù)雜,其具體病因及胚胎形成機(jī)制至今尚未完全闡明。目前普遍認(rèn)為可能在妊娠期,特別是在妊娠早期肛門直腸發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期受外界因素如病毒感染、化學(xué)物質(zhì)、環(huán)境及營(yíng)養(yǎng)因素等干擾引起宮內(nèi)環(huán)境不良而導(dǎo)致發(fā)育異常。為進(jìn)一步闡明該病的發(fā)病機(jī)制,本研究借助全因組甲基化芯片及生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)ARM患兒末端直腸組織全基因組甲基化狀態(tài)進(jìn)行研究；并對(duì)胚胎發(fā)育分化密切相關(guān)基因SHH在ARM中的甲基化狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證,旨在進(jìn)一步闡明表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制在ARM發(fā)病中的可能作用,以求為尋找有效的預(yù)防和治療手段提供理論依據(jù)。 第一部分先天性肛門直腸畸形患兒末端直腸全基因組甲基化狀態(tài) 目的利用全基因組甲基化芯片技術(shù)及生物信息學(xué)方法對(duì)先天性肛門直腸畸形患兒末端直腸組織的全基因組甲基化狀態(tài)進(jìn)行研究,篩選差異甲基化位點(diǎn)及基因,以進(jìn)一步闡明該病的發(fā)病機(jī)制。 方法收集先天性肛門直腸畸形患兒(高位畸形5例,中位畸形5例,低位畸形10例)和非胃腸道畸形患兒(6例,均為我院診斷并行手術(shù)治療的肛瘺)的末端直腸組織。分組原則：分為中高位組、低位組和對(duì)照組,將同組病例的組織標(biāo)本混合檢測(cè)一張芯片,力圖使組間差異最大而組內(nèi)差異最小。采用人類全基因組甲基化芯片(450K Infinium Methylation BeadChip)對(duì)全基因組中大于450000的CpG島或CpG位點(diǎn)進(jìn)行差異甲基化分析。每個(gè)CpG位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩個(gè)探針：甲基化和去甲基化探針。對(duì)所得差異基因甲基化位點(diǎn)進(jìn)行校正方法及差異分析。 結(jié)果在先天性肛門直腸畸形患兒末端直腸組織全基因組DNA中共篩選出32731個(gè)差異甲基化位點(diǎn),其中15141個(gè)發(fā)生低甲基化,17590個(gè)發(fā)生高甲基化。我們根據(jù)基因的功能不同,再進(jìn)一步增加限定條件后,發(fā)現(xiàn)部分發(fā)育分化相關(guān)基因高甲基化占有優(yōu)勢(shì),如SHH、Wnt5a、Fgf10、Cdx1等 結(jié)論先天性肛門直腸畸形患兒末端直腸標(biāo)本全基因組中部分發(fā)育分化相關(guān)基因相對(duì)高甲基化占有優(yōu)勢(shì),如Wnt5a、Fgf10、Cdx1等均處于高甲基化狀態(tài)。而與人類胚胎發(fā)育,尤其是肛門直腸和腸神經(jīng)系統(tǒng)(Entric nervous system, ENS)的發(fā)育密切相關(guān)的SHH基因亦處于高甲基化狀態(tài)。 第二部分先天性肛門直腸畸形患兒末端直腸SHH基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)及轉(zhuǎn)錄水平表達(dá) 目的研究先天性肛門直腸畸形患兒末端直腸組織中發(fā)育分化密切相關(guān)基因SHH啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài),并觀察其轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況。 方法選取20例肛門直腸畸形(高位5例,中位5例,低位10例)及6例非胃腸道畸形對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比研究；分為中高位組、低位組和對(duì)照組。術(shù)中留取末端直腸組織,提取組織的DNA和RNA；實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time RT-PCR)檢測(cè)SHH的mRNA表達(dá)水平。亞硫酸氫鈉-測(cè)序法檢測(cè)SHH啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平。 結(jié)果與對(duì)照組相比,中高位組和低位組中SHH啟動(dòng)子區(qū)平均甲基化程度明顯增高(p值分別為0.0036和0.0087),轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)明顯減低(p分別為0.0065和0.0156)；中高位組相對(duì)于低位組,SHH啟動(dòng)子區(qū)平均甲基化程度亦明顯增高(p=0.0095),轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)明顯減低(p=0.0252)。SHH基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與其轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.89,p0.05)。 結(jié)論先天性肛門直腸畸形中,SHH基因啟動(dòng)子區(qū)處于高甲基化狀態(tài),并且調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平低表達(dá),此表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制可能在先天性肛門直腸畸形發(fā)病起著重要作用。
【關(guān)鍵詞】：先天性肛門直腸畸形 全基因組甲基化芯片 DNA甲基化 先天性肛門直腸畸形 DNA甲基化 SHH 啟動(dòng)子區(qū)甲基化
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R726.5
【目錄】：

• 目錄3-4
• 中文摘要4-7
• Abstract7-10
• 引言10-12
• 第一部分 先天性肛門直腸畸形患兒末端直腸全基因組甲基化狀態(tài)12-27
• 前言12
• 材料和方法12-22
• 結(jié)果22-24
• 討論24-27
• 第二部分 先天性肛門直腸畸形患兒末端直腸SHH基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)及轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)27-39
• 前言27-28
• 材料和方法28-35
• 結(jié)果35-36
• 討論36-39
• 結(jié)論39
• 創(chuàng)新點(diǎn)39-40
• 參考文獻(xiàn)40-44
• 英文縮寫索引44-45
• 綜述45-53
• 參考文獻(xiàn)50-53
• 致謝53-54

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 Hartman E.E.;Oort F.J.;Visser M.R. ;鄭世成;;肛門直腸畸形或先天性巨結(jié)腸成年患者生活質(zhì)量改變的原因分析[J];世界核心醫(yī)學(xué)期刊文摘(胃腸病學(xué)分冊(cè));2006年Z1期

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本文編號(hào)：917314