本文關(guān)鍵詞：兒童腎母細(xì)胞瘤中自噬抑制及其意義探討

  更多相關(guān)文章： 自噬 G401細(xì)胞 腎母細(xì)胞瘤 腫瘤輔助治療

【摘要】：目的 腎母細(xì)胞瘤又稱腎胚胎瘤或Wilm氏瘤,是最常見的腹部惡性腫瘤,其發(fā)病率在小兒腹部腫瘤中占首位,占兒科惡性腫瘤的6%。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,腎母細(xì)胞瘤中存在Bcl-2表達(dá)升高,p53變異,以及β-catenin激活,已知這幾種分子均可通過調(diào)控自噬參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展,故推測腎母細(xì)胞瘤存在自噬失調(diào)。細(xì)胞自噬是一種主要由溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞對內(nèi)容物自我降解的過程,是細(xì)胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種保護(hù)性機(jī)制,但過度自噬對細(xì)胞有殺傷作用,已經(jīng)被納入為一種腫瘤的特征性活動(dòng)。目前尚無關(guān)于自噬和腎母細(xì)胞瘤關(guān)系的相關(guān)報(bào)道。本研究探究腎母細(xì)胞瘤中自噬的特征性變化,自噬調(diào)控如何影響腎母細(xì)胞瘤增殖,意在進(jìn)一步闡釋腎母細(xì)胞瘤發(fā)病機(jī)理,并探索是否可以通過調(diào)控自噬水平,提出比傳統(tǒng)治療方案更高效低毒的抑瘤方案。 材料和方法 本研究采用細(xì)胞系G401(ATCC購進(jìn)),組織標(biāo)本采集：所有標(biāo)本來自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院組織標(biāo)本庫。所涉及的自噬調(diào)控藥物以及化療藥物3-MA、CQ、Rapamycin、 VCR來自Sigma, Cayman等試劑公司,。所用特異性抗體以及HRP標(biāo)記二抗：p62,Beclin1,LC3來自MBL,Sigma,Santa Crus,Invitrogen等試劑公司。 1.了解腎母細(xì)胞瘤中的自噬水平。組織層面：RT-PCR法檢測化療后腎母細(xì)胞瘤組織以及癌旁相對正常腎組織中自噬相關(guān)基因LC3,BECLIN1,P62和ATG5mRNA水平的表達(dá)；應(yīng)用免疫組化方法檢測化療前后,腎母細(xì)胞瘤組織以及癌旁相對正常腎組織LC3、Beclin1,p62蛋白水平的變化,以及耐藥腫瘤組織中上述三種蛋白的表達(dá)；Western-blotting測化療后腎母細(xì)胞瘤組織以及癌旁相對正常腎組織中自噬蛋白p62,Beclin1,LC3的水平。 2.明確自噬調(diào)控能否協(xié)同常規(guī)化療藥(VCR)殺傷腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞。選取腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞G401,使用MTT法檢測細(xì)胞活力。明確單用各自噬調(diào)控藥物(CQ/3-MA/rapamycin)以及單用化療藥物對G401的生長抑制,比較聯(lián)用自噬調(diào)控藥物后常規(guī)化療藥對目的細(xì)胞殺傷效用的影響(與化療藥拮抗或者協(xié)同或疊加)。 3.分析自噬調(diào)控藥物(CQ/3-MA/rapamycin)以及化療藥(VCR)如何影響G401細(xì)胞自噬。選取合理的藥物劑量,處理細(xì)胞24小時(shí),用RIPA裂解液裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,Western-blotting檢測自噬蛋白p62,LC3水平,分析有效調(diào)控劑量。 4.進(jìn)一步驗(yàn)證自噬抑制是否影響腫瘤生長,以及藥物作用是否通過自噬。應(yīng)用慢病毒(帶有GFP-SiRNA-ATG7)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染G401,有效下調(diào)ATG7后,用不同濃度的自噬誘導(dǎo)藥物rapamycin,比較4TG7表達(dá)抑制組與對照組中rapamycm對細(xì)胞生長的抑制程度。 結(jié)果 1.組織層面：Q-PCR結(jié)果顯示,相較于癌旁組織,癌組織：BECLIN1/P62/ATG5/LC3基因mRNA水平表達(dá)均增高(△CT根據(jù)三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果用mean±SE法表示,通過T檢驗(yàn)分析,P0.05視為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異具有顯著性)。Western-blotting結(jié)果顯示,相較于癌旁相對正常組織,治療后癌組織Beclin1蛋白無明顯改變,p62堆積,LC3Ⅰ和LC3Ⅱ增多。免疫組化半定量結(jié)果顯示：治療前的癌組織較正常組織Beclin1,p62,LC3蛋白表達(dá)均低,其中Beclin1顯著。治療后(化療)癌組織Beclin1, p62, LC3水平均回升,且化療耐藥癌組織Beclin1, p62, LC3亦呈高水平。 2.細(xì)胞層面：1.VCR20nM能產(chǎn)生對G401細(xì)胞50%左右的抑制率,而繼續(xù)增加VCR濃度不能顯著提高細(xì)胞抑制率。2.自噬抑制藥物(3-MA/CQ)對G401有殺傷作用,小劑量有效；自噬激動(dòng)劑rapamycin對G401亦有殺傷作用但抑制率不高,最大抑制率約為20%。3.VCR (20nM)聯(lián)用自噬抑制藥物(3-MA/CQ)以后,對G401的殺傷作用并無協(xié)同殺傷作用,甚至拮抗；而聯(lián)用自噬誘導(dǎo)藥物rapamycin后,對G401的殺傷明顯提升,低劑量時(shí)聯(lián)用協(xié)同作用最強(qiáng)。4. Western-blotting結(jié)果顯示,在G401中,3-MA有效抑制自噬(上游)劑量為0.5mM; CQ有效抑制自噬(下游)劑量為10μM; Rapamycin有效促進(jìn)自噬(上游)劑量為1μM;0-50nM VCR對自噬并無明顯調(diào)控作用。 3.自噬相關(guān)基因干擾：慢病毒(轉(zhuǎn)染所需)本身對G401細(xì)胞生長有一定抑制作用。在此基礎(chǔ)上,在下調(diào)ATG7以后,細(xì)胞生長進(jìn)一步受到抑制,而rapamycin對ATG7敲減的G401的生長抑制比對照組明顯減弱。 結(jié)論 1.未化療兒童腎母細(xì)胞瘤普遍存在自噬抑制,化療有激活自噬的作用,但對腫瘤細(xì)胞具有抑制作用或保護(hù)作用未知。自噬激活可能參與化療抵抗。 2.自噬抑制(CQ/3-MA與siRNA ATG7)可顯著殺傷腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞G401,自噬誘導(dǎo)(Rapamycin)對G401也有一定殺傷作用。 3.自噬抑制藥物(CQ/3-MA)聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥VCR對腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞無協(xié)同殺傷效應(yīng),甚至部分拮抗；而自噬誘導(dǎo)藥物rapamycin聯(lián)用20nMVCR對G401有明顯協(xié)同殺傷效應(yīng)。 4.Rapamycin對G401的生長抑制作用是通過調(diào)控自噬。
【關(guān)鍵詞】：自噬 G401細(xì)胞 腎母細(xì)胞瘤 腫瘤輔助治療
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.11
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 縮略詞表12-13
• 主要儀器設(shè)備13-15
• 目次15-16
• 引言16-22
• 第一部分 腎母細(xì)胞瘤組織中的自噬水平鑒定22-43
• 1. 試驗(yàn)材料22-27
• 2. 試驗(yàn)方法27-33
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-38
• 4. 討論38-42
• 5. 結(jié)論42-43
• 第二部分 自噬調(diào)控藥物與常規(guī)化療藥物對腎母細(xì)胞瘤腫瘤的聯(lián)合治療作用43-62
• 1. 試驗(yàn)材料43-46
• 2. 試驗(yàn)方法46-50
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果50-57
• 4. 討論57-61
• 5. 結(jié)論61-62
• 全文總結(jié)及展望62-64
• 參考文獻(xiàn)64-70
• 綜述70-86
• 參考文獻(xiàn)81-86
• 作者簡歷及在讀期間所取得的科研成果86-87

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 周紅;許文;陳小娥;;瘢痕疙瘩同位素治療方法的臨床研究[J];東南國防醫(yī)藥;2013年04期

2 柯丹霞;印遇龍;;小G蛋白對mTOR信號通路的調(diào)控[J];動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào);2013年08期

3 崔永奇;耿沁;顧愛琴;朱淼鑫;孔韓衛(wèi);孫磊;劉蕾;閆明霞;姚明;;肺腺癌骨轉(zhuǎn)移裸小鼠模型的建立及MicroCT觀察[J];中國肺癌雜志;2013年09期

4 李海明;;動(dòng)態(tài)增強(qiáng)MRI在卵巢腫瘤中的研究進(jìn)展[J];放射學(xué)實(shí)踐;2013年09期

5 侯麗穎;孫燕佩;張旭光;趙棟;吳坤;;維生素E琥珀酸酯通過Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞SGC-7901發(fā)生保護(hù)性自噬[J];癌變.畸變.突變;2013年05期

6 楊蓓;陳雪;丁金蘭;;RNAi介導(dǎo)的Nrf2表達(dá)下調(diào)對亞砷酸鈉誘發(fā)的小鼠胰島β細(xì)胞毒性損傷的影響[J];中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志;2013年05期

7 程玉;李春輝;;胃癌中Cx43與PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)性的研究進(jìn)展[J];承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2013年05期

8 李艷華;魏素菊;;凝血功能與非小細(xì)胞肺癌相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展[J];中國肺癌雜志;2013年12期

9 陳松峰;邵增務(wù);;自噬相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究進(jìn)展[J];國際骨科學(xué)雜志;2013年04期

10 王峗;柯飛;趙安芳;陳蘭英;;自噬在癌癥發(fā)生中的雙重作用[J];癌變.畸變.突變;2013年06期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 Xuejun Jiang;Zunzhen Zhang;;Sodium arsenite and arsenic trioxide differently affect the oxidative stress,genotoxicity and apoptosis in A549 cells:an implication for the paradoxical mechanism[A];第十一屆全國博士生學(xué)術(shù)年會(huì)（生物醫(yī)藥專題）論文集（下冊，，墻報(bào)P25-P48）[C];2013年

2 Jian Xiao;Wanglei Qu;Qiong Chen;;A Novel Monocarbonyl Analogue of Curcumin Induced Human Ovarian Cancer Cells Apoptosis Via Activation Endoplasmic Reticulum Stress and Autophagy Signaling Pathway[A];抗腫瘤藥物研究新進(jìn)展與腫瘤個(gè)性化藥物治療論壇論文集[C];2013年

3 劉敏霞;周可成;曹毅;;新的肺癌相關(guān)基因MCRS1病理生理功能研究[A];第十六屆中國科協(xié)年會(huì)——分3環(huán)境污染及職業(yè)暴露與人類癌癥學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2014年

4 王彩蓮;;肺癌抗血管生成的治療機(jī)制及最新進(jìn)展[A];中國腫瘤內(nèi)科進(jìn)展 中國腫瘤醫(yī)師教育（2014）[C];2014年

5 魯倩倩;陳同洋;秦鵬鈞;姜學(xué)軍;;真菌次級代謝產(chǎn)物Rasfonin(A304)引起細(xì)胞死亡機(jī)理研究[A];中國菌物學(xué)會(huì)第六屆會(huì)員代表大會(huì)（2014年學(xué)術(shù)年會(huì)）暨貴州省食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展高峰論壇會(huì)議摘要[C];2014年

6 孟韜;馬蘭萍;于霆;王昕;余科;沈競康;;mTOR激酶抑制劑SCC-31的臨床前研究[A];第十二屆全國青年藥學(xué)工作者最新科研成果交流會(huì)論文集[C];2014年

7 Hao-Peng Sun;Zheng-Yu Jiang;Meng-Chen Lu;Qi-Dong You;;Discovery of potent Keap 1-Nrf2 Protein-Protein Interaction Inhibitor Based on Molecular Binding Determinants Analysis and structure-guided modification[A];第十二屆全國青年藥學(xué)工作者最新科研成果交流會(huì)論文集[C];2014年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王鑫鑫;SIRT1對胃癌惡性生物學(xué)行為的影響及作用機(jī)制研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2013年

2 鄭慧芬;自噬在系統(tǒng)性炎癥所致黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元損傷中的作用及機(jī)制研究[D];蘇州大學(xué);2013年

3 楊愛民;Neuronostatin對痛覺、胃腸運(yùn)動(dòng)和情緒的影響及脂基化蛋白LC3-Ⅱ的半合成[D];蘭州大學(xué);2013年

4 黃星;凋亡抑制蛋白XIAP抑制自噬促進(jìn)腫瘤形成的作用機(jī)制研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2013年

5 王振波;LC3A在食管鱗癌中的放化療敏感性預(yù)測作用[D];山東大學(xué);2013年

6 劉峗;調(diào)控鑷鈷基納米材料及納米基因載體的自噬效應(yīng)在腫瘤診療中的應(yīng)用[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2013年

7 成娟;自噬在白血病K562/ADM細(xì)胞多藥耐藥性及三氧化二砷抗白血病效應(yīng)中的作用[D];蘭州大學(xué);2013年

8 沈薇;卵巢衰老相關(guān)基因的功能驗(yàn)證和機(jī)制探討[D];華中科技大學(xué);2013年

9 高愛梅;芹菜素通過抑制Nrf2-ARE通路逆轉(zhuǎn)肝癌耐藥的研究[D];華中科技大學(xué);2013年

10 朱智能;FOXQ1介導(dǎo)TGF-β1/Smad信號通路調(diào)控膀胱癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)研究[D];華中科技大學(xué);2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 魏芳;ApoG2對乳腺癌MCF-7細(xì)胞放射增敏作用及與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用協(xié)同效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

2 陸玉熊;基于ERK1/2通路探討高壓氧對MCAO大鼠大腦皮質(zhì)損傷的作用及其機(jī)制[D];吉林大學(xué);2013年

3 李園園;吉西他濱衍生物SL-01對人乳腺癌的抑制作用研究[D];山東大學(xué);2013年

4 尚斌;抑制自噬對內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)靜脈血栓機(jī)化再通的影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘇州大學(xué);2013年

5 陳小慧;p53、p21、VEGF和CXCR4在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)及意義[D];蘇州大學(xué);2013年

6 陳露;基質(zhì)細(xì)胞Cav-1表達(dá)影響骨髓瘤細(xì)胞對蛋白酶體抑制劑的敏感性[D];蘇州大學(xué);2013年

7 吳庭楓;A2B5~+/CD133~-與CD133~+/A2B5~-膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球表型特點(diǎn)及其移植瘤病理實(shí)驗(yàn)研究[D];蘇州大學(xué);2013年

8 蘇朋;大鼠脊髓損傷后自噬的變化及高壓氧對其影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘇州大學(xué);2013年

9 劉榮雕;凡納濱對蝦免疫相關(guān)分子LVAKT與LVFLOT的初步研究[D];國家海洋局第三海洋研究所;2013年

10 田一虹;亞精胺誘導(dǎo)Hela細(xì)胞自噬與降低細(xì)胞活力關(guān)系的研究[D];蘭州大學(xué);2013年

本文編號：898023