本文關鍵詞：新生兒乙型肝炎病毒宮內(nèi)感染傳播途徑的分子機制研究

  更多相關文章： 乙型肝炎病毒 母嬰傳播 外周血單個核細胞 原位聚合酶鏈反應 滾環(huán)擴增

【摘要】：目的:了解HBs A陽性孕婦其新生兒發(fā)生HBV宮內(nèi)感染的危險因素,為預防和控制新生兒HBV宮內(nèi)感染提供參考。探討乙型肝炎病毒感染外周血單個核細胞的情況,并利用原位PCR技術檢測PBMC中HBV的表達情況,研究PBMC在發(fā)生HBV宮內(nèi)感染中的作用。內(nèi)容與方法:1.新生兒HBV宮內(nèi)感染危險因素分析(1)研究對象連續(xù)收集2008年8月至2012年9月北京地區(qū)各級醫(yī)院產(chǎn)前檢查的HBs Ag陽性孕婦及其新生兒共312對作為隊列,收集研究對象的臨床流行病學數(shù)據(jù)并采集血液標本。(2)研究方法1)流行病學調(diào)查:采用巢式病例對照研究的方法,使用統(tǒng)一定制的調(diào)查表,對研究對象進行詳細詢問并記錄,同時將臨床檢查結(jié)果一并填寫進調(diào)查表中。2)血清學檢測:采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)雙抗夾心法,對研究對象的血液標本中的HBs Ag和HBe Ag進行檢測;選取HBV S基因啟動子和終止子附近的保守序列設計引物,檢測血清和PBMC中的HBV DNA。3)統(tǒng)計分析方法:先將資料進行核查,然后錄入Epi Data 3.1,建立數(shù)據(jù)庫,然后用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理與分析;計量資料的結(jié)果使用±S表示,分析方法使用t-text檢驗分析;計數(shù)資料的結(jié)果使用率或構(gòu)成比表示,比較時使用t-text或者χ2檢驗;使用Excel2013和Graph Pad Prism5.0軟件對圖表進行處理。2.PBMC轉(zhuǎn)染實驗以及細胞原位PCR技術檢測PBMC中HBV DNA和ccc DNA(1)PBMC轉(zhuǎn)染實驗通過PCR擴增得到HBV DNA基因組全長片段,通過連接構(gòu)建入T載體,轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞后,經(jīng)涂板藍白斑篩選陽性后擴大培養(yǎng),使用含去除內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒后,利用擴增時加入的酶切位點,酶切產(chǎn)物,得到高濃度HBV DNA全基因組質(zhì)粒。分離健康人PBMC后,經(jīng)過電轉(zhuǎn)染方式將HBV DNA轉(zhuǎn)染進入健康人PBMC中,通過培養(yǎng)后檢測PBMC中HBV的表達。(2)細胞原位PCR技術檢測PBMC中的HBV DNA和ccc DNA將獲得的HBV感染者的血漿,經(jīng)過Ficoll密度梯度離心法分離得到PBMC,通過細胞甩片機將PBMC離心固定至粘附載玻片上,利用原位PCR技術檢測PBMC中的HBV DNA;使用滾環(huán)擴增加跨缺口原位PCR技術檢測PBMC中的ccc DNA,在顯微鏡下觀察其HBV DNA和ccc DNA在細胞中的分布和位置。結(jié)果1.HBV母嬰傳播的危險因素分析(1)HBs Ag陽性孕婦其嬰兒血液標本的實驗室檢測結(jié)果分析對312例HBs Ag陽性孕婦及其新生兒的實驗室檢測結(jié)果表明,共142例孕婦其新生兒發(fā)生了HBV宮內(nèi)感染,宮內(nèi)感染率為45.5%(142/312)。142例宮內(nèi)感染的新生兒中,血清HBs Ag陽性24例(7.7%,24/312),血清HBV DNA陽性61例,(19.6%,61/312),外周血單個核細胞中HBV DNA陽性81例,(26.0%,81/312)。其中有15例(4.8%,15/312)新生兒同時檢測出血清HBs Ag陽性和HBV DNA陽性,9例(2.9%,9/312)新生兒全部檢測結(jié)果均陽性。(2)HBs Ag陽性母親發(fā)生新生兒HBV宮內(nèi)感染的危險因素分析綜合312例HBs Ag陽性母親及其新生兒的臨床流行病學數(shù)據(jù)、人口學調(diào)查數(shù)據(jù)及實驗室檢測結(jié)果進行分析,結(jié)果顯示:170例(54.5%170/312)新生兒未發(fā)生宮內(nèi)感染,142例(45.5%,142/312)新生兒發(fā)生宮內(nèi)感染;母親PBMC HBV DNA陽性100例(32.1%,100/312),其中67例發(fā)生宮內(nèi)感染,33例未發(fā)生宮內(nèi)感染,經(jīng)卡方檢驗χ2=27.40,p0.001;母親HBe Ag檢測陽性人數(shù)78例(25%,78/312)其中54例發(fā)生宮內(nèi)感染,24例未發(fā)生宮內(nèi)感染,經(jīng)卡方檢驗χ2=20.82,p0.001;母親血清HBV DNA陽性137例(43.9%,137/312),其中73例發(fā)生宮內(nèi)感染,64例未發(fā)生宮內(nèi)感染,經(jīng)卡方檢驗χ2=5.95,p=0.0147;表明母親PBMC HBV DNA、血清HBV DNA和HBe Ag陽性是發(fā)生新生兒HBV宮內(nèi)感染的危險因素,其它因素如分娩年齡、分娩方式、新生兒體重等均與HBV宮內(nèi)感染無關。進一步分析母親血清中HBV DNA含量與新生兒HBV宮內(nèi)感染的關系發(fā)現(xiàn),血清中HBV DNA的含量越高,發(fā)生宮內(nèi)感染的概率越大。血清HBVDNA含量高于106copies/ml的孕婦對比血清HBVDNA含量低于103copies/ml的孕婦,其新生兒發(fā)生宮內(nèi)感染的相對危險度為5.33(95%CI為2.78~10.2);血清HBV DNA在103copies/ml至106copies/ml之間的孕婦相對危險度為2.61(95%CI為1.07~6.38),經(jīng)趨勢卡方檢驗三組宮內(nèi)感染率差異有統(tǒng)計學意義,χ2值為28.24,p0.001。2.HBV DNA電轉(zhuǎn)染PBMC實驗利用PCR成功提取出HBV DNA全基因組序列,經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產(chǎn)物條帶與預期結(jié)果一致;連接轉(zhuǎn)化后將提取的目的基因連接產(chǎn)物雙酶切,其產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定;使用紫外分光光度計測得目的基因質(zhì)粒濃度為20ng/ml;質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)染的方式轉(zhuǎn)染健康人PBMC,培養(yǎng)6小時和24小時后的提取細胞DNA,利用熒光定量PCR方法檢測細胞中HBV DNA的拷貝數(shù),分別為5.67×103copies/ml和7.4×104copies/ml。3.發(fā)生宮內(nèi)感染新生兒PBMC細胞原位檢測分析利用原位PCR技術檢測乙型肝炎患者PBMC細胞中HBV DNA的表達情況,以乙型肝炎患者肝組織石蠟切片為陽性對照,以核固紅染色為背景顏色,肝組織和PBMC的細胞核中可以觀察到藍紫色團塊;通過滾環(huán)擴增加跨缺口原位PCR技術對ccc DNA進行檢測,在肝組織和細胞的細胞核中發(fā)現(xiàn)有藍紫色團塊。在對孕婦PBMC中ccc DNA原位檢測的過程中發(fā)現(xiàn),原位檢測的陽性率與血清HBV DNA含量有相關性,通過對比74例樣本發(fā)現(xiàn),外周血HBV DNA含量高,PBMC中檢測ccc DNA的陽性率越高。25例外周血HBV DNA含量高于106copies/ml的患者中HBV ccc DNA陽性43例(89.6%,43/48),26例外周血HBV DNA含量低于106copies/ml的患者中HBV ccc DNA陽性12例(46.2%,12/26),經(jīng)卡方檢驗χ2=16.7,p0.001;在針對62例母嬰對的嬰兒PBMC原位檢測結(jié)果匯總發(fā)現(xiàn),25例發(fā)生宮內(nèi)感染的嬰兒,其中22例PBMC中ccc DNA檢測陽性,陽性率88%(22/25),fisher精確卡方計算結(jié)果顯示p0.001。結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn),HBs Ag陽性孕婦的血清HBe Ag、血清HBV DNA和PBMC HBV DNA陽性為生新生兒宮內(nèi)感染的高危因素,對嬰兒PBMC中HBV DNA的檢測有助于判斷宮內(nèi)感染的發(fā)生;通過轉(zhuǎn)染乙型肝炎病毒至健康人外周血單個核細胞,通過熒光定量PCR和細胞原位PCR技術檢測證實PBMC可以感染HBV。利用滾環(huán)擴增加跨缺口原位PCR技術檢測新生兒PBMC中ccc DNA證實宮內(nèi)感染的發(fā)生與PBMC有關,被HBV感染的PBMC在發(fā)生新生兒HBV宮內(nèi)感染的過程中發(fā)揮重要作用。
【關鍵詞】：乙型肝炎病毒 母嬰傳播 外周血單個核細胞 原位聚合酶鏈反應 滾環(huán)擴增
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R722.13
【目錄】：

• 縮略詞表4-5
• 中文摘要5-9
• Abstract9-13
• 前言13-16
• 第一部分 新生兒乙型肝炎病毒宮內(nèi)感染危險因素分析16-27
• 1. 概述16-17
• 2. 材料與方法17-22
• 3. 結(jié)果22-25
• 4. 討論25-26
• 5. 結(jié)論26-27
• 第二部分 外周血單個核細胞在HBV母嬰傳播中的作用研究27-56
• 第一節(jié) 外周血單個核細胞轉(zhuǎn)染HBV DNA27-40
• 1. 概述27-28
• 2. 材料、儀器與方法28-36
• 3. 結(jié)果36-38
• 4. 討論38-39
• 5. 結(jié)論39-40
• 第二節(jié) 原位聚合酶鏈反應檢測外周血單個核細胞中HBV DNA和ccc DNA40-56
• 1. 概述40-41
• 2. 材料、儀器與方法41-50
• 3. 結(jié)果50-54
• 4. 討論54-55
• 5. 結(jié)論55-56
• 討論56-59
• 結(jié)論59-60
• 參考文獻60-66
• 作者簡介66-67
• 致謝67

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本文編號：859045