兒童血清25羥基維生素D水平及其受體基因多態(tài)性與哮喘的相關(guān)性研究

發(fā)布時間：2017-08-22 03:44

本文關(guān)鍵詞：兒童血清25羥基維生素D水平及其受體基因多態(tài)性與哮喘的相關(guān)性研究

【摘要】：一.研究背景支氣管哮喘是一種常見的呼吸道疾病,也是影響兒童健康最常見的慢性氣道疾病之一,在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率逐年上升,給患者家庭及社會帶來了沉重的健康及經(jīng)濟負擔,因此對支氣管哮喘進行深入的研究具有深遠的社會意義。支氣管哮喘是由嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T細胞、氣道上皮細胞等多種炎性細胞共同參與,它的重要特征是持續(xù)性氣道炎癥,慢性氣道高反應(yīng)性和可逆性氣流阻塞。引起患兒反復(fù)發(fā)作的喘息、氣促、胸悶或咳嗽等,并多在夜間和(或)清晨發(fā)作或加劇。嚴重者可出現(xiàn)哮喘持續(xù)狀態(tài)危及生命,影響了患兒的身心健康。哮喘的發(fā)病機制復(fù)雜,與免疫和遺傳學背景等密切相關(guān)。近年來,國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),維生素D (VitD)在哮喘的病因?qū)W中可能發(fā)揮著重要的作用。既往研究認為維生素D具有調(diào)節(jié)骨代謝和鈣平衡的作用,而今越來越多的流行病學、遺傳學和動物模型實驗研究表明,其作為一種第二類固醇激素,還具有強大的免疫調(diào)節(jié)作用,與固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答均有密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)它可抑制各種Th1免疫反應(yīng)介導的自身免疫性疾病的演進,如炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)、類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis, MS)、I型糖尿病(Type1Diabetes Mellitus，，T1DM)等,并可能參與了哮喘的發(fā)病。相關(guān)研究表明減少陽光暴露與哮喘發(fā)病有關(guān),而維生素D被認為是聯(lián)系陽光暴露與哮喘發(fā)病之間的中介物。維生素D缺乏與不足在全世界均有較高的發(fā)病率,甚至發(fā)生在陽光暴露很充足地區(qū)的人群中,兒童是其高危群體,而25-(OH)-VD是人血清中含量最多且最穩(wěn)定的VitD3代謝物,也是判斷體內(nèi)在皮膚合成的或經(jīng)飲食攝入的VitD3含量的最佳指標。因此,在哮喘兒童中檢測其維生素D水平具有重要的臨床意義。支氣管哮喘屬IgE介導的Ⅰ型慢性變態(tài)反應(yīng)性疾病,CD4+T淋巴細胞被認為在支氣管哮喘的發(fā)病過程中起重要的調(diào)控作用,根據(jù)其分泌的細胞因子不同,分為Th1、Th2兩個亞群,目前認為Thl/Th2細胞失衡是哮喘發(fā)病的重要基礎(chǔ)。越來越多的研究證實維生素D通過多種免疫細胞如肥大細胞、樹突狀細胞(DCS)、調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)等及其分泌的細胞因子的相互作用在哮喘的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用。有資料表明,維生素D缺乏可能導致Tregs功能下降,Thl和Th2之間的平衡被打破。Camargo等研究證實1,25-(OH)-VD抑制Thl細胞的分化,實驗證明它在體外對于初始T細胞極化過程中(Th分化的初期更明顯)IL-4的產(chǎn)生有下調(diào)作用,對于Th2細胞分化及氣道嗜酸性粒細胞也有著很好的抑制作用。Topilski等建立了雞卵白蛋白(Ovalbumin, OVA)鼠哮喘模型,實驗發(fā)現(xiàn)在哮喘誘發(fā)的最初階段或Th2細胞分化完成階段給予1,25-(OH)-VD顯著地抑制了氣道炎癥反應(yīng)和降低了支氣管肺泡灌洗液中IL-4的水平。1,25-(OH)-VD可抑制效應(yīng)性T細胞遷移,使其不能順利到達其發(fā)揮效應(yīng)的炎癥部位。因而1,25-(OH)-VD對哮喘的影響機制可能包括下調(diào)IL-4和阻斷效應(yīng)T細胞遷移這兩個方面。Pichler等發(fā)現(xiàn)在人類臍血單個核細胞中維生素D不僅抑制由IL-12介導的IFN-γ產(chǎn)生,同時也抑制了IL-4及由IL-4介導的IL-13的產(chǎn)生；但也有相反的證據(jù),Aheu等對相當于人類預(yù)防佝僂病劑量的1,25-(OH)-VD與哮喘發(fā)病間的關(guān)系進行了動物實驗研究發(fā)現(xiàn)維生素D可以促進抗原特異性T淋巴細胞的增殖,上調(diào)IL-4及IL-13等Th2型細胞因子的分泌,增加IgE的分泌。維生素D對Th2分化的作用及其具體機制如何,有待于更多的實驗研究證實。血清維生素D水平與日照時間、地理位置、飲食等因素有關(guān),如紫外線強度及量適中促進維生素D吸收,海拔高的地方較海拔低的地方更易發(fā)生維生素D不足與缺乏等。除此以外,血清維生素D水平還與遺傳因素密切相關(guān)。目前已發(fā)現(xiàn)了大量的與維生素D代謝及作用途徑中相關(guān)的基因多態(tài)性,如細胞色素P4502R1(CYP2R1)基因、維生素D (VDR)基因、GC-球蛋白(GC)基因、細胞色素P45024A1(CYP24A1)基因等的突變可導致維生素D水平的異常。目前研究最多的是CYP2R1基因、VDR基因。自1994年Morrison首次報道VDR基因多態(tài)性與骨密度的關(guān)系以來,對VDR基因多態(tài)性與糖尿病、結(jié)核、骨代謝、生長發(fā)育相關(guān)性的研究,一直是學者們關(guān)注的熱點。VDR是維生素D生物活性形式1,25-(OH)-VD發(fā)生作用的主要受體,VDR基因于1988年被克隆出來,其定位于12q12-q14,長度為60-70kb,包括9個編碼的外顯子,共編碼427個氨基酸,有多項研究顯示VDR基因是觀察哮喘基因非常好的候選者,其多態(tài)性與兒童和成人哮喘的發(fā)生具有相關(guān)性。VDR基因有5個常見的單核苷酸多態(tài)性位點(single nucleotide polymorphisms, SNPs)分別是FokI(rs2228570)、BsmI (rs1544410)、Tru9I(rs757343)、ApaI(rs7975232)和TaqI (rs731236),分別位于第2外顯子、第8內(nèi)含子和第9外顯子,及在3’端下游區(qū)域的poly-A多態(tài)性。rs2228570(FokI)位于第2外顯子,在VDR基因的起始密碼子上為T→C變異形成的。導致編碼氨基酸密碼子427ATG→ACG突變,使得翻譯起始位點位于3個密碼子以后,即翻譯的蛋白質(zhì)少3個氨基酸,為424個氨基酸,轉(zhuǎn)錄活性大大增強；rs7975232(ApaI)位于VDR基因第8個內(nèi)含子,由于G→T突變,導致胸腺嘧啶突變?yōu)轼B嘌呤；rs1544410(BsmI)則由于G→A突變,其多態(tài)性雖不影響VDR的氨基酸序列,但蛋白質(zhì)的合成受mRNA3'末端非翻譯區(qū)的調(diào)控,rs1544410和rs7975232的多態(tài)位點正位于該區(qū)域,其堿基的改變影響了mRNA的穩(wěn)定性,從而影響了VDR的表達；rs731236(TaqI)多態(tài)位點則是位于VDR的第9外顯子,327ATT→ATC突變,其多態(tài)性是由無義突變引起,雖不會使VDR的氨基酸序列改變,但可能會導致mRNA的穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)錄效率的改變,也會影響到VDR的表達；rs757343(Tru9I)位點也位于VDR基因第8個內(nèi)含子,其發(fā)生G→A突變,2000年由法國Ye等首先發(fā)現(xiàn)并報道,Zajickova等2003年再次證明了此位點的存在,多個研究表明BsmI、ApaI、TaqI、Tru9I這四個位點存在著連鎖不平衡(Linkage disequilibrium, LD),尤其是BsmI和TaqI之間。BsmI還與位于3’非翻譯區(qū)的poly(A)存在強烈連鎖。目前研究顯示VDR的SNP存在改變VDR蛋白的表達或在功能上的改變影響了維生素D活性,另外,由于VDR許多目的基因是通過一個經(jīng)典的內(nèi)分泌途徑來調(diào)控維生素D的代謝,因此VDR蛋白分子或其功能上的任何改變都可能影響維生素D的代謝,從而促成哮喘的發(fā)生。近年來,VDR基因多態(tài)性在佝僂病、癌癥、糖尿病、骨質(zhì)疏松等疾病已被廣泛報告,與哮喘的關(guān)系也越來越引起大家的關(guān)注。Poon AH等的兩項以北美家庭為研究對象的研究中發(fā)現(xiàn)VDR基因多態(tài)位點與哮喘的具有相關(guān)性,rs2228570(FokI)的存在導致第2外顯子編碼氨基酸密碼子427ATG→ACG突變,影響了VDR轉(zhuǎn)錄活性；國內(nèi),Aaadi、Fang、Li等的三項針對VDR基因常見的多態(tài)位點與哮喘的關(guān)聯(lián)研究中未有陽性發(fā)現(xiàn)；最近一項來自法國224個家庭的951個哮喘兒童的研究,雖然在VDR基因中發(fā)現(xiàn)了13種單核苷酸多態(tài)性(包括FokI、 BsmI、 TaqI),但是其與哮喘發(fā)生之間的聯(lián)系卻不具有統(tǒng)計學意義；而一項在突尼斯兒童對VDR基因的多態(tài)性研究中發(fā)現(xiàn),rs2228570(FokI)、rs1544410(BsmI)、rs731236(TaqI)在哮喘組與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學意義,增加了兒童發(fā)展為哮喘的危險性,而對于rs7975232(ApaI)未發(fā)現(xiàn)其與哮喘有相.關(guān),該研究還發(fā)現(xiàn)BsmI-ApaI-TaqI存在強烈的連鎖不平衡,可能影響mRNA的表達和穩(wěn)定性,改變VDR基因翻譯效率及VDR蛋白的表達,從而改變了哮喘患兒的表型。上述研究結(jié)果不一致,可能是因為基因的異質(zhì)性和環(huán)境不同所造成。不同人群SNP的分布頻率不同,同時哮喘是一種復(fù)雜的多基因遺傳性疾病,許多基因錯綜復(fù)雜的相互作用及累積效應(yīng),使得遺傳存在著差異,哮喘的易感性還與環(huán)境因素有關(guān),如吸煙(被動或主動)、空氣中粉塵、寵物、職業(yè)暴露等,這些均可影響實驗最終的結(jié)果。目前國內(nèi)外對于rs2228570(FokI)、rs7975232(Apal). rs1544410(BsmI)、rs731236(TaqI)、rs757343(Tru9I)基因突變與兒童支氣管哮喘的相關(guān)性研究報道較少。二.研究目的本實驗通過對哮喘患兒血清中血清25羥基維生素D水平和各T細胞亞群代表性細胞因子的檢測,以及哮喘兒童維生素D受體基因多態(tài)性分析,擬探討25-(OH)-VD.Thl/Th2在哮喘發(fā)病中的作用,分析哮喘的免疫學發(fā)病機制,為哮喘的免疫學治療方法及其遺傳易感性的篩選提供一定的理論和實驗依據(jù)。三.材料與方法 1、研究對象及分組 1.1哮喘組2012年3月-2013年6月于本院門診隨診的40例哮喘患兒(臨床緩解期),男22例,女18例,年齡6個月-3歲,平均(1.91±0.61)歲。其納入標準均符合2008年中華醫(yī)學會兒科學會呼吸學組制定的兒童支氣管哮喘診斷標準：(1)反復(fù)發(fā)作喘息、咳嗽、氣促、胸悶,多與接觸變應(yīng)原、冷空氣、物理或化學性刺激、呼吸道感染以及運動等有關(guān),常在夜間和(或)清晨發(fā)作或加劇。(2)發(fā)作時在雙肺可聞及散在或彌漫性,以呼氣相為主的哮鳴音,呼氣相延長。(3)上述癥狀和體征經(jīng)抗哮喘治療有效或自行緩解。(4)除外其他疾病所引起的喘息、咳嗽、氣促和胸悶。入組前一周均無使用激素及急性感染病史。 1.2對照組：2012年3月-2013年6月于本院健康體檢兒童40例,男21例,女19例;年齡6個月-3歲,平均(1.85±0.59)歲。均無過敏性疾病病史,入組前一周均無使用激素及急性感染病史。 1.3所有研究對象均為漢族,在深圳生活的兒童。 1.4兩組兒童組間性別、年齡差異、維生素D的使用情況均無統(tǒng)計學意義,家長均知情同意參加該項研究。 2、標本采集兩組兒童均于清晨空腹留取外周靜脈血3ml,其中1ml,于室溫(20～25℃)放置60min,2000r／min離心l0min,制備血清,-70℃冰箱凍存?zhèn)錂z。另外2ml,提取全基因組DNA,-20℃冰箱凍存?zhèn)錂z。 3、血清25-(OH)-VD、IL-4、IL-5.IFN-γ的測定 3.1采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試驗測定血清25-(OH)-VD、IL-4、IL-5.IFN-γ水平。所有的檢測步驟均嚴格按說明書進行。 4、VDR多態(tài)位點rs2228570(FokI)、rs7975232(ApaI)、rs1544410(BsmI)、 rs731236(TaqI)、rs757343(Tru9I)的檢測 4.1采用PCR擴增結(jié)合DNA直接測序法探測VDR基因有無多態(tài)位點rs2228570、 rs7975232. rs1544410、rs731236、rs757343存在 4.1.1采用苯酚/氯仿提取法提取全基因組DNA。 4.1.2設(shè)計涵蓋VDR多態(tài)位點rs2228570、rs7975232、rs1544410、rs731236、rs757343的特異引物。 4.1.3擴增目的基因。 4.1.4基因測序及序列比對分析 3、數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料用x±s表示,根據(jù)方差齊性結(jié)果,組間采用兩獨立樣本t或t’檢驗；計數(shù)資料采用卡方檢驗。P0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。四.結(jié)果 1、血清25-(OH)-VD、IL-4、IL-5、IFN-γ的測定結(jié)果 1.1哮喘組與正常對照組比較,25-(OH)-VD水平均低于正常對照組,差異有統(tǒng)計學意義(t=7..498,P0.001)。 1.2哮喘組與正常對照組比較,IL-4水平均高于正常對照組,差異有統(tǒng)計學意義(t=14.03,P0.001)。 -1.3哮喘組與正常對照組比較,IL-5水平均高于正常對照組,差異有統(tǒng)計學意義(t=6.7,P0.001)。 1.4哮喘組與正常對照組比較,IFN-γ水平均低于正常對照組,差異有統(tǒng)計學意義(t=6.4,P0.001)。 2、VDR多態(tài)位點rs2228570、rs7975232、rs1544410、rs731236、rs757343的檢測 2.1VDR基因序列rs2228570(FokI)基因型分為野生型TT,突變型TC、CC,在哮喘組和對照組內(nèi)均檢測到這三種基因型,但在兩組內(nèi)的分布無明顯的差別(x2=0.854,P=0.652),等位基因T、C在兩組中的分布差異無統(tǒng)計學意義(x2=0.948,P=0.330),其OR和95%可信區(qū)間CI分別為0.824(0.556-1.220)和1.130(0.882-1.448)。 2.2VDR基因序列rs7975232(ApaI)基因型分為野生型GG,突變型GT、TT,在哮喘組和對照組內(nèi)未檢測到突變型TT,基因型GG、GT在兩組內(nèi)的分布有明顯的差異(x2=7.218, P=0.007), GG、 GT基因型0R和95%可信區(qū)間(CI)分別為1.923(1.158-3.193)和0.556(0.353-0.875)。 2.3VDR基因序列rs731236(TaqI)基因型分為野生型TT,突變型TC、CC,在哮喘組和對照組內(nèi)未檢測到突變型CC,基因型TT、TC在兩組內(nèi)的分布有明顯的差異(x2=8.455,P=O.004),TT、TC基因型OR和95%可信區(qū)間(CI)分別為2.00(1.212-3.301)和0.519(0.323-0.833)。 2.4VDR基因序列rs11574114(本研究發(fā)現(xiàn)的多態(tài)位點)基因型分為野生型GG,突變型GC、CC,在哮喘組和對照組內(nèi)均檢測到這三種基因型,在兩組內(nèi)的分布有明顯的差異(x2=7.632,P=0.022),等位基因G、C的0R和95%可信區(qū)間(CI)分別為0.661(0.510-0.875)和1.952(1.276-2.986)。 2.5VDR基因序列rs1544410(Bsm I)基因型分為野生型GG,突變型GA、AA,在哮喘組和對照組內(nèi)未檢測到突變型從,基因型GG、GA在兩組內(nèi)的分布有明顯的差異(X2=7.366, P=0.007), GG, GA基因型OR和95%可信區(qū)間(CI)分別為0.586(0.390-0.881)和2.091(1.183-3.695)。 2.6VDR基因序列rs757343(Tru9I)基因型分為野生型GG,突變型GA、AA,在’哮喘組和對照組內(nèi)均檢測到這三種基因型,在兩組內(nèi)的分布有明顯的差異(x2=6.651,P=0.036),等位基因G、A的OR和95%可信區(qū)間(CI)分別為0.684(0.525-0.891)和1.783(1.188-2.675)。五.結(jié)論本課題采用酶聯(lián)免疫吸附實驗、PCR擴增、基因測序等技術(shù)研究了血清25-(OH)-VD、IL-4、IL-5、IFN-γ在哮喘發(fā)病中的作用以及VDR基因多態(tài)性與兒童哮喘的相關(guān)性。通過研究我們得到以下結(jié)論： 1、哮喘患兒血清25-(OH)-VD濃度降低,提示我們哮喘患兒可能存在血清25-(OH)-VD不足或缺乏,血清25-(OH)-VD可能在哮喘發(fā)病中發(fā)揮作用。 2、VDR基因多態(tài)位點rs7975232、rs1544410、rs731236、rs11574114、 rs757343基因型及等位基因分布在兩組間存在差異,其多態(tài)性可能與哮喘發(fā)病相關(guān)；VDR多態(tài)位點rs2228570基因型分布在兩組間不存在差異,其多態(tài)性可能與哮喘不相關(guān)。 3、哮喘患兒血清中IL-4、IL-5表達升高,IFN-γ分泌下降,提示我們哮喘患兒可能存在T細胞亞群細胞因子失衡,即Thl細胞功能不足及Th2細胞功能亢進,Th1/Th2失衡可能在哮喘發(fā)病中發(fā)揮作用。
【關(guān)鍵詞】：哮喘 25-(OH)D3 IL-4 IL-5 IFN-γ 基因多態(tài)性 VDR rs2228570 FokI rs7975232 ApaI rs1544410 BsmI rs731236 TaqI rs11574114 rs757343 Tru9I
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R725.6
【目錄】：