本文關(guān)鍵詞：柯薩奇病毒A組16型感染性cDNA構(gòu)建及應(yīng)用

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【摘要】：手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是由多種腸道病毒感染引起的兒童急性傳染性疾病,柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A16,CVA16)為其主要的病原體之一。CVA16屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬(Enterovirus)人腸道病毒A種(Human enterovirus A,HEV-A)。病毒呈20面體立體對稱的球形結(jié)構(gòu),無囊膜。CVA16基因組包含7410個核苷酸,為單股正鏈RNA。CVA16感染常呈輕癥反應(yīng),偶發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和心肌炎,但近些年研究結(jié)果顯示CVA16也可導(dǎo)致重癥病例,若CVA16和EV71共感染易導(dǎo)致病毒重組引發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和HFMD大暴發(fā)。本研究將實驗室選育的疫苗候選株CVA16-P4-L731進(jìn)行傳代,通過一日齡Balb/C小鼠感染性實驗獲知疫苗候選株在選育傳代過程中發(fā)生了毒力減弱的現(xiàn)象。其中CVA16-P4-L731-P6相比于CVA16-P4-L731-P1在核苷酸1434(C-T)、2744(A-G)、2747(A-G)、3161(G-A)、3182(A-G)、4968(C-T)和6064(C-T)處發(fā)生了堿基改變,這些堿基突變均導(dǎo)致了相應(yīng)編碼氨基酸的變化,這些氨基酸分別是VP2 161(T-M)、VP1 102(N-D)、VP1 103(T-A)、VP1 241(E-K)、VP1 248(T-A)、2C 297(S-F)和3D 42(E-A)。本研究通過反向遺傳學(xué)技術(shù)以CVA16-P4-L731-P1為模板構(gòu)建了全長c DNA,并在Vero細(xì)胞上進(jìn)行了病毒拯救,對拯救后的病毒進(jìn)行致細(xì)胞病變、病毒核酸和蛋白合成的檢測,證實其具有感染性,為研究CVA16病毒的毒力位點提供了工具和手段。本研究還以CVA16-P4-L731-P6為模板構(gòu)建了4株重組病毒克隆株,同時將CVA16-P4-L731-P6進(jìn)行空斑純化挑選出一株病毒克隆株,拯救的CVA16-P4-L731-P1株和CVA16-P4-L731-P6株經(jīng)過腹腔注射一日齡Balb/C小鼠測定各病毒株的LD50,通過比較各個病毒株LD50的差異得知2C 297、VP1102和VP1 241可能與CVA16-P4-L731-P6在一日齡Balb/C小鼠模型上的減毒有關(guān)。同時成功通過感染性c DNA以2BS細(xì)胞為基質(zhì)進(jìn)行病毒拯救,獲得沒有Vero細(xì)胞傳代背景的有感染性且滴度較高的病毒,數(shù)據(jù)顯示感染性c DNA作為毒種庫可以在較短代次內(nèi)獲得較高滴度的病毒,降低病毒突變的風(fēng)險,初步探索感染性c DNA在改變疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)方面的應(yīng)用。
【關(guān)鍵詞】：柯薩奇病毒A組16型 感染性c DNA 病毒拯救 重組病毒克隆 減毒位點 2BS基質(zhì)
【學(xué)位授予單位】：武漢生物制品研究所
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R725.1
【目錄】：

• 英文縮略詞表5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-20
• 第一章 實驗材料和方法20-46
• 1.1 實驗材料20
• 1.2 主要試劑（名稱，公司，，貨號）20-21
• 1.3 主要儀器與設(shè)備（公司，型號）21-22
• 1.4 主要試劑和培養(yǎng)基的配制22-24
• 1.5 通用實驗方法24-29
• 1.6 實驗方法29-46
• 第二章 CVA16-P4-L731-P1全長c DNA的構(gòu)建46-55
• 2.1 CVA16-P4-L731-P1和-P6株在Balb/C小鼠模型上的毒力檢測46-47
• 2.2 CVA16-P4-L731-P1和-P6序列分析47-50
• 2.3 CVA16-P4-L731-P1全長c DNA的構(gòu)建50-54
• 2.4 小結(jié)54-55
• 第三章 在Vero細(xì)胞基質(zhì)上的病毒拯救及驗證55-61
• 3.1 體外轉(zhuǎn)錄55
• 3.2 病毒RNA轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞55-56
• 3.3 拯救后病毒驗證56-59
• 3.4 小結(jié)59-61
• 第四章 重組病毒克隆株的構(gòu)建及減毒位點的確立61-68
• 4.1 CVA16-P4-L731-P6亞克隆的構(gòu)建61-62
• 4.2 重組病毒克隆株的構(gòu)建62-64
• 4.3 重組病毒株的獲得64
• 4.4 CVA16-P4-L731-P6空斑純化64-66
• 4.5 動物實驗66-67
• 4.6 小結(jié)67-68
• 第五章 在 2BS細(xì)胞基質(zhì)上的病毒拯救及驗證68-72
• 5.1 病毒RNA轉(zhuǎn)染 2BS細(xì)胞68
• 5.2 拯救后病毒驗證68-71
• 5.3 小結(jié)71-72
• 第六章 總結(jié)和討論72-79
• 6.1 總結(jié)72-73
• 6.2 討論73-78
• 6.3 后期展望78-79
• 參考文獻(xiàn)79-85
• 綜述85-92
• 參考文獻(xiàn)89-92
• 附錄92-100
• 致謝100

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本文編號：714103