本文關(guān)鍵詞：PTEN抑制劑在新生鼠腸道損傷修復中的作用研究

  更多相關(guān)文章： PTEN抑制劑(phen) 新生鼠腸道損傷修復模型 PTEN Lgr5 p-β-catenin

【摘要】：目的：制備新生鼠腸道損傷修復模型,給予PTEN抑制劑-phen干預腸道損傷修復過程。通過腸道組織病理切片,按照Nadler評分標準[1]評估腸道病理損傷情況,觀察腸道損傷修復過程中不同時間點腸道組織病理改變。通過Real time PCR、Western blot技術(shù),觀察損傷修復過程中Lgr5、β-catenin和PTEN mRNA及蛋白的表達及隨時間變化情況。初步探索PTEN抑制劑phen在新生鼠腸道損傷修復中的作用。 第一部分PTEN抑制劑作用于新生鼠腸道損傷修復模型的組織學變化研究 方法：利用缺氧和冷刺激復制新生大鼠腸道損傷修復模型。1日齡新生鼠(清潔級,SD大鼠)隨機分為正常對照組(N)、實驗對照組(C)及干預組(E)。均由母鼠喂養(yǎng)。正常對照組不給予任何刺激與干預。實驗對照組和干預組,每天早8點和晚8點同時給予缺氧(含6%02的N2,30min)及冷刺激(4℃冰箱,20分鐘)各1次,連續(xù)3天。每天第1次缺氧冷刺激后,干預組另給予phen1.6μmol/kg/d (生理鹽水溶解,濃度為0.08μmol/ml)腹腔注射,而實驗對照組則給予相同容量生理鹽水腹腔注射。制模過程中觀察新生鼠對刺激的反應(yīng)、進食情況及活動狀況,觀察新生鼠有無腹脹、腹瀉及胃潴留,并于實驗前和實驗后第4天(完成制模后24h)測量體重,比較各組新生鼠體重變化情況。分別于實驗最后一次缺氧和冷刺激后24h(1d)、48h(2d)、72h(3d)和120h(5d)脫臼處死新生大鼠5只,標記為N1、N2、N3、N5; C1、C2、C3、C5和E1、E2、E3、E5(各組5只,共60只)。取新生鼠回盲部腸道組織做病理切片,用Nadler評分標準[1]評估腸道損傷與修復情況。 結(jié)果： 1.制模過程中,實驗對照組和干預組新生鼠相繼出現(xiàn)不同程度的進食減少、活動下降,并伴有不同程度的腹瀉、腹脹。 2.實驗前,正常對照組、實驗對照組和干預組新生鼠平均體重分別為7.36±0.10g、7.59±0.19g和7.60±O.11g,三組新生鼠平均體重差異不具有統(tǒng)計學意義,P=0.407；實驗后,正常對照組、實驗對照組和干預組的平均體重分別為11.17±0.15、10.38±0.31和10.75±0.14g,實驗對照組體重明顯低于正常對照組,P=0.032,差異具有有統(tǒng)計學意義。干預組平均體重雖低于正常對照組但高于實驗對照組,組間差異不具有統(tǒng)計學意義,PEvsN=0.054、PEvsC=0.295。 3.標本取材中發(fā)現(xiàn),實驗對照組和干預組新生鼠腹腔有不同程度的渾濁,甚至血性滲液,腸管色澤異常,呈節(jié)段性水腫充血、斑片狀出血或彈性消失,解剖時偶可見到腹腔內(nèi)有糞便。 4. HE染色正常對照組的回盲部絨毛結(jié)構(gòu)完整,排列規(guī)則；腺體排列規(guī)則、組織結(jié)構(gòu)清楚；固有層血管無擴張,無明顯充血及炎性細胞浸潤。干預組和實驗對照組中可見不同程度的粘膜及粘膜下層充血水腫；固有層炎癥細胞浸潤；粘膜不同程度的點狀、片狀壞死脫落；病理評分介于1-3級之間。干預組、實驗對照組病理損傷程度明顯重于正常對照組,三樣本比較的秩和檢驗差異具有統(tǒng)計學意義,P=0.000,干預組較實驗對照組平均病理損傷程度較輕,但無統(tǒng)計學差異,p=0.468。 結(jié)論： 1.6%O2缺氧30min及4℃冷刺激20mmin制備的新生鼠腸道損傷修復模型,外觀表現(xiàn)、體重變化及腸道組織病理改變明顯,且模型存活時間較長,更有利于組織病理的實驗研究。 2.模型中病理損傷最重出現(xiàn)于實驗后第2、3天,第5天腸道病理損傷程度較第2、3天減輕,反映腸道損傷后自我修復過程。 3. PTEN抑制劑干預新生鼠腸道損傷修復過程,可改善其外觀表現(xiàn),體重較病變組增加,病理損傷程度減輕,但不具統(tǒng)計學意義,P=0.468。 第二部分PTEN抑制劑影響腸道損傷修復過程中Lgr5、β-catenin和PTEN基因表達的實驗研究 方法：同第一部分實驗方法,復制新生鼠腸道損傷修復模型同時給予PTEN抑制劑--phen干預,分為正常對照組(N)、實驗對照組(C)和干預組(E)。分別于最后一次缺氧冷刺激后的24h (1d)、48h(2d)和72h(3d)取回盲部腸道標本(標記為N1、N2、N3;C1、C2、C3; E1、E2、E3,每組5只,共45只)。通過Real-time PCR和Western Blot分子生物學技術(shù),測定腸道組織勻漿中Lgr5、β-catenin和PTEN基因的mRNA及蛋白的表達水平,初步探索PTEN抑制劑在腸道損傷修復過程中的影響作用。 結(jié)果： 1. Lgr5mRNA及蛋白表達水平：C組與E組制模后均較N組升高,且E組更高于C組。Lgr5mRNA表達升高,C1組vs N1組,P=0.031；E1組vs C1組,P=0.032；E2組vsC2組,P=0.005,差異有統(tǒng)計學意義；C2組vs N2組,P=0.264；C3組vs N3組,P=0.146,E3組vs C3組,P=0.081,不具統(tǒng)計學差異。Lgr5蛋白表達升高,C1組vs N1組,P=0.045；E1組vs C1組,P=0.036；差異有統(tǒng)計學意義。C2組vs N2組,P=0.062；C3組vs N3組,P=0.059；E2組vs C2組,P=0.093；E3組vs C3組,P=O.177,不具統(tǒng)計學差異。 2. β-catenin mRNA及蛋白表達水平：C組與E組制模后均較N組升高,且E組更高于C組。β-catenin mRNA表達升高,C1組vs N1組,P=0.039；E1組vs C1組,P=0.008；E2組vsC2組,P=0.010,差異有統(tǒng)計學意義；C2組vs N2組,P=0.060；C3組vs N3組,P=0.200,E3組vs C3組,P=0.077,不具統(tǒng)計學差異。p-β-catenin蛋白表達升高,C1組vsN1組,P=0.013；C2組vs N2組,P=0.007；E1組vs C1組,P=0.043；差異有統(tǒng)計學意義；C3組vs N3組,P=0.052；E2組vs C2組,P=0.109；E3組vs C3組,P=0.094,不具統(tǒng)計學差異。 3. PTEN mRNA及蛋白表達水平：C組與E組制模后均較N組下降,且E組更低于C組。PTEN mRNA表達下降,C1組vs N1組,P=0.038；E1組vs C1組,P=0.003；E2組vsC2組,P=0.030；E3組vs C3組,P=0.030,差異有統(tǒng)計學意義；C2組vs N2組,P=0.134；C3組vs N3組,P=0.679,不具統(tǒng)計學差異。PTEN蛋白表達下降,C1組vs N1組,P=0.037；E2組vs C2組,P=0.008；E3組vsC3組,P=0.048,差異有統(tǒng)計學意義；C2組vs N2組,P=0.123；C3組vs N3組,P=0.522,E1組vs C1組,P=0.093；不具統(tǒng)計學差異。 4. Lgr5與P-catenin mRNA表達水平呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)r=0.885,P=0.000；Lgr5與PTEN mRNA的表達水平呈負相關(guān),相關(guān)系數(shù)r=-0.877,P=0.000。Western blot Lgr5、p-β-catenin、PTEN蛋白的表達水平趨勢和Real time PCR Lgr5、β-catenin、PTEN mRNA的表達水平和相一致,Lgr5和p-β-catenin蛋白的表達水平呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)r=0.789,P=0.000;Lgr5和PTEN蛋白平均水平呈負相關(guān),相關(guān)系數(shù)r=-0.823,P-0.000。 5. PTEN蛋白的表達C3組高于C1組,P=0.022,其余Lgr5、β-catenin和PTEN mRNA及蛋白表達水平在各自組內(nèi)、不同時間點的變化比較均無顯著性差異。 結(jié)論： 1.腸道損傷修復期,Lgr5和P-catenin轉(zhuǎn)錄與蛋白表達水平升高,與修復期腸道干細胞分化、增殖增加有關(guān)。PTEN表達增加可能為機體的負反饋調(diào)節(jié)機制所致。 2. PTEN抑制劑通過下調(diào)PTEN mRNA和蛋白表達水平,從而上調(diào)Lgr5和P-catenin mRNA和蛋白表達水平,以促進腸道損傷后腸干細胞的分化與增殖,加速腸粘膜損傷后修復。 3. PTEN抑制劑在一定程度上可促進腸道損傷后的修復,其可能的機制與PI3K/Akt信號通路活性增強有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：PTEN抑制劑(phen) 新生鼠腸道損傷修復模型 PTEN Lgr5 p-β-catenin
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R722.1
【目錄】：

• 中英文單詞對照表4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-15
• 第一部分 PTEN抑制劑作用于新生鼠腸道損傷修復模型的組織學變化研究15-23
• 實驗材料與方法15-17
• 實驗結(jié)果17-21
• 討論21-22
• 結(jié)論22-23
• 第二部分 PTEN抑制劑在腸道損傷修復過程中影響Lgr5、β-catenin和PTEN基因表達的作用研究23-43
• 實驗材料與方法23-29
• 結(jié)果29-36
• 討論36-42
• 結(jié)論42-43
• 結(jié)論43-44
• 參考文獻44-47
• 研究生期間完成論文47-48
• 致謝48-49
• 附頁49-58

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