本文關(guān)鍵詞：一種基于懸液芯片的呼吸道病毒多重檢測方法

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【摘要】：呼吸道病毒是常見的引發(fā)急性呼吸道疾病的病原體,當(dāng)大規(guī)模流行性疾病暴發(fā)或急性呼吸道疾病需要盡快進(jìn)行臨床診斷時,快速鑒定病原體對疾病控制和治療是至關(guān)重要的。本文旨在建立一種基于懸液芯片技術(shù)的多種呼吸道病毒并行快速檢測方法,以BioPlex-200懸液芯片技術(shù)檢測平臺為基礎(chǔ),依據(jù)NCBI公開數(shù)據(jù)庫中呼吸道病毒的基因組序列,設(shè)計各種針對呼吸道病毒的特異性引物組和核酸探針,用多重不對稱PCR方法結(jié)合懸液芯片檢測的方式,可在5-6個小時的時間內(nèi)實現(xiàn)10種呼吸道病毒或亞型的快速檢測,從而達(dá)到節(jié)省時間、節(jié)約成本和降低勞動量的目的。 依據(jù)NCBI公開數(shù)據(jù)庫上各病毒的基因序列信息,選定病毒基因組中的保守區(qū)域為檢測靶點,針對10種呼吸道病毒或亞型,包括腺病毒(AdV),偏肺病毒(hMPV),流感病毒A型(IfA),流感病毒B型(IfB),呼吸道合胞病毒(RSV),副流感病毒1型(PIV1),副流感病毒2型(PIV2),副流感病毒3型(PIV3), SARS病毒(SARS),人類皰疹病毒1型(HSV1),設(shè)計并合成相應(yīng)引物組和探針序列,病毒核酸直接經(jīng)PCR或反轉(zhuǎn)錄后經(jīng)PCR對目的序列進(jìn)行擴(kuò)增,產(chǎn)物與核酸探針微球組雜交,于BioPlex-200懸液芯片系統(tǒng)檢測熒光信號值。經(jīng)過檢測方法的優(yōu)化,各病毒的檢測靈敏度分別能達(dá)到：IfA約30DNA拷貝；AdV、IfB、PIV2、 PIV3、RSV、HSV1與SARS約3DNA拷貝；hMPV和PIV1約1DNA拷貝。對29個經(jīng)傳統(tǒng)方法鑒定為呼吸道病毒的臨床樣本,在懸液芯片檢測中,共檢測出陽性樣本27個,檢出率93.1%。部分臨床樣本經(jīng)測序分析,檢測結(jié)果與懸液芯片結(jié)果一致。
【關(guān)鍵詞】：呼吸道病毒 懸液芯片 多重PCR 不對稱PCR
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R725.6
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-7
• 引言7-10
• 第一章 材料與方法10-24
• 第一節(jié) 材料10-11
• 1. 樣本來源10
• 1.1 病毒標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株10
• 1.2 臨床標(biāo)本10
• 1.3 陽性對照樣本10
• 2. 主要試劑10-11
• 3. 儀器設(shè)備11
• 第二節(jié) 方法11-24
• 1. 病毒標(biāo)準(zhǔn)克隆與陽性對照克隆的構(gòu)建11-19
• 1.1 目的序列的選擇12-14
• 1.2 樣本來源14
• 1.3 核酸的抽提14
• 1.4 病毒RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈14-15
• 1.5 PCR擴(kuò)增15
• 1.6 構(gòu)建病毒特異性序列克隆15-18
• 1.7 測序驗證18-19
• 2. 核酸探針微球制備19-22
• 2.1 核酸探針的設(shè)計與合成19-20
• 2.2 羧基微球的選擇20
• 2.3 核酸探針與羧基微球偶聯(lián)20-21
• 2.4 雜交驗證21-22
• 3. 樣本核酸抽提22
• 4. 多重呼吸道病毒懸液芯片檢測方法22-24
• 4.1 多重反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)22
• 4.2 多重PCR擴(kuò)增22-23
• 4.3 雜交23
• 4.4 信號標(biāo)記23
• 4.5 檢測23
• 4.6 測序驗證23-24
• 第二章 結(jié)果24-32
• 第一節(jié) 構(gòu)建克隆的測序結(jié)果24-26
• 第二節(jié) 核酸探針微球偶聯(lián)效果驗證結(jié)果26-27
• 第三節(jié) 呼吸道病毒懸液芯片檢測體系的構(gòu)建及樣本檢測結(jié)果27-32
• 1. PCR條件優(yōu)化27-28
• 2. 雜交條件優(yōu)化28
• 3. 特異性和靈敏度檢測28-30
• 3.1 特異性檢測28-29
• 3.2 靈敏度檢測29-30
• 4. 臨床樣本檢測30-32
• 第三章 討論32-36
• 第一節(jié) 構(gòu)建克隆結(jié)果討論32
• 1. 克隆測序及序列比對32
• 2. 構(gòu)建克隆的應(yīng)用32
• 第二節(jié) 核酸探針微球制備的討論32-33
• 第三節(jié) 呼吸道病毒懸液芯片檢測體系的構(gòu)建及樣本檢測結(jié)果的討論33-36
• 結(jié)論36-37
• 參考文獻(xiàn)37-39
• 綜述39-55
• 參考文獻(xiàn)52-55
• 致謝55-56

【相似文獻(xiàn)】

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