本文關鍵詞：斑馬魚MeCP2的多克隆抗體制備及其對NOTCH信號通路的調(diào)控

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【摘要】：目的：構建重組原核表達質(zhì)粒pGEX-4T-1/zMe/eCP2(170-223),轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichiacoli, E.coli)感受態(tài)DH5a中誘導表達融合蛋白GST-zMeCP2(170-223)。經(jīng)純化的融合蛋白GST-zMeCP2(170-223)為抗原免疫新西蘭大白兔(NZW Rabbit)獲得兔抗斑馬魚抗體。甲基化-CpG結合蛋白2 (methyl-CpG-binding protein 2, MeCP2)基因突變引起進行性神經(jīng)疾病-瑞士綜合癥,通過原位雜交技術和激光共聚焦顯微技術,利用Notch轉(zhuǎn)基因魚(Tg(Tp 1 bglob:hmgb 1-mCherry))來研究MeCP2對斑馬魚神經(jīng)發(fā)育的調(diào)控。方法：(1)斑馬魚MeCP2目的蛋白的表達和純化及多克隆抗體的制備。選擇斑馬魚MeCP2氨基酸(170-223)對應的基因序列為目的片段,以pEGFP-C1/MeCP2為模板擴增目的片段,將目的片段克隆到表達載體pGEX-4T-1中構建重組質(zhì)粒,獲得重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/zMeCP2(170-223)。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR驗證和測序鑒定正確后轉(zhuǎn)化至DH5a中,經(jīng)IPTG誘導表達。將誘導后的菌株用GST瓊脂糖凝膠親和層析純化。SDS-PAGE分析純化蛋白。用純化的蛋白免疫新西蘭大白兔,制備抗血清。(2)兔抗斑馬魚多克隆抗體的驗證和功能檢測：利用斑馬魚、大、小鼠腦組織通過Western-blot驗證。利用免疫共沉淀技術,通過質(zhì)譜,進一步驗證MeCP2抗體的特異性及完成對MeCP2蛋白復合物的檢測。運用免疫熒光技術對MeCP2進一步定位。(3)斑馬魚顯微注射和胚胎原位雜交技術：斑馬魚胚胎發(fā)育在1-2細胞期注入6 nL的orpholino (MO)或mRNA,對特定基因的下調(diào)或過表達。胚胎收集與固定,4℃過夜,次日進行胚胎脫水,復水,洗滌,蛋白酶K處理,預雜交,雜交,封閉,洗滌,染色,胚胎信號采集。(4)免疫熒光技術：制備斑馬魚腦組織冷凍切片,封閉,一抗孵育過夜,熒光二抗避光孵育,含有DAPI的封片劑封片，熒光顯微鏡照相。結果：(1)以pEGFP-C1/MeCP2為模板經(jīng)PCR擴增獲得了162 bp的目的基因,通過雙酶切和連接,成功構建了重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/zMe/eCP2(170-223),經(jīng)PCR驗證和測序鑒定目的基因質(zhì)粒構建。含pGEX-4T-1/zMeCP2(170-223)的重組質(zhì)粒經(jīng)過IPTG誘導,純化獲得GST-zMeCP2(170-223)融合蛋白。經(jīng)考馬斯亮藍染色,在32 kDa分子量處有特異性條帶與預期的蛋白分子量相符。以純化的融合蛋白為抗原免疫新西蘭大白兔獲得兔抗斑馬魚MeCP2 (zMeCP2)抗體。(2)考馬斯亮藍染色顯示,zMeCP2抗體可以識別斑馬魚MeCP2蛋白,IP-westernblot結果顯示,zMeCP2抗體能夠富集并特異性識別大鼠MeCP2蛋白,成年斑馬魚腦組織免疫熒光顯示，，MeCP2蛋白核定位。(3)質(zhì)譜鑒定結果顯示,多種蛋白分子與MeCP2存在相互作用,有兩種經(jīng)過Co-IP驗證確定,分別是RNA Binding Motif Protein 4(RBM4)和PUR家族。其中PUR家族purA和purB之間能形成穩(wěn)定的復合物,二者與MeCP2均能形成穩(wěn)定的復合物。(4)原位雜交和免疫熒光實驗顯示,MeCP2在胚胎發(fā)育過程前期廣泛表達,隨后逐漸集中表達在腦部。在Notch轉(zhuǎn)基因魚(Tg(Tplbglob:hmgbl-mCherry))胚胎，Notch在敲低MeCP2的胚胎中的表達與野生型胚胎相比也明顯降低,再共注射NICD-RNA后,Notch表達得到恢復。在敲低MeCP2的胚胎中,標志神經(jīng)成熟的神經(jīng)因子Ngn1、Pax2、 Pax3、Eno2、Map和RNA結合蛋白HUC表達下調(diào)。靶基因hey2,在敲低MeCP2的胚胎中的表達與野生型胚胎相比也明顯降低。結論：(1)成功構建了pGEX-4T-1/zMeCP2(170-223)重組表達質(zhì)粒,表達純化得到了GST-zMeCP2(170-223)的融合蛋白。(2)表達純化的zMeCP2(170-223)蛋白能夠刺激兔子產(chǎn)生兔抗斑馬魚的MeCP2多克隆抗體。(3)得到的兔抗斑馬魚MeCP2的多克隆抗體能夠特異性識別鼠源MeCP2并且可以用來做免疫共沉淀。(4)質(zhì)譜鑒定出多種與MeCP2目互作用的蛋白,其中可以肯定的有PUR家族和RBM4。(5)PUR家族purA和purB之間能形成穩(wěn)定的復合物,二者與MeCP2均能形成穩(wěn)定的復合物。(6) MeCP2在胚胎神經(jīng)發(fā)育前期廣泛表達,敲低MeCP2能延緩胚胎神經(jīng)細胞發(fā)育。(7) MeCP2能夠通過Notch-hey2信號通路來調(diào)控斑馬魚神經(jīng)細胞的分化。
【關鍵詞】：斑馬魚 MeCP2 多克隆抗體制備 Notch信號通路
【學位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R749.94;Q78
【目錄】：

• 摘要7-9
• 主要縮略語英文索引9-10
• 前言10-15
• (1) MeCP2基因和蛋白的結構特點10-11
• (2) MeCP2的功能研究11-12
• (3) 斑馬魚神經(jīng)發(fā)育模型12-13
• (4) Notch信號通路13-15
• 材料和方法15-29
• 1 材料15-20
• 1.1 斑馬魚品系15
• 1.2 表達質(zhì)粒15
• 1.3 主要耗材15-20
• 1.3.1 主要儀器15-16
• 1.3.2 主要試劑16-17
• 1.3.3 主要試劑的配制17-20
• 2 方法20-29
• 2.1 抗體制備的技術路線20
• 2.2 抗原選擇及引物設計20-21
• 2.3 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/MeCP2(170-223)構建與驗證21-22
• 2.3.1 目的基因的獲得21
• 2.3.2 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/zMeCP2(170-223)的構建21-22
• 2.3.3 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/zMeCP2(170-223)的驗證22
• 2.4 GST-zMeCP2(170-223)融合蛋白的表達和純化22-23
• 2.4.1 GST-zMeCP2(170-223)融合蛋白表達條件的摸索22
• 2.4.2 GST-zMeCP2(170-223)融合蛋白的純化22-23
• 2.5 兔抗斑馬魚zMeCP2(170-223)抗體的獲得23
• 2.6 Western檢測和免疫共沉淀23-24
• 2.6.1 Western檢測23
• 2.6.2 免疫共沉淀23-24
• 2.7 斑馬魚腦組織冷凍切片的制備及免疫熒光24
• 2.8 斑馬魚的飼養(yǎng)24-25
• 2.9 斑馬魚的顯微注射25-26
• 2.10 斑馬魚胚胎免疫熒光染色26
• 2.11 熒光成像拍攝26
• 2.12 斑馬魚胚胎原位雜交26-29
• 結果29-44
• 1 PCR擴增結果和重組質(zhì)粒的構建及驗證結果29-30
• 2 融合蛋白GST-zMeCP2(170-223)的表達條件摸索及純化結果30-32
• 3 zMeCP2抗體的IP-western blot分析與免疫熒光32-34
• 4 部分質(zhì)譜鑒定結果及相關IP-western blot驗證結果34-35
• 5 MeCP2在斑馬魚神經(jīng)發(fā)育過程中的表達35-36
• 6 注射MeCP2-MO斑馬魚表型變化36-37
• 7 注射MeCP2-MO后NOTCH信號的表達變化37-39
• 8 敲低MeCP2的胚胎對神經(jīng)因子表達影響39-42
• 9 注射MeCP2-MO后轉(zhuǎn)錄抑制因子hey2的表達變化42-44
• 討論44-47
• 全文結論47-49
• 參考文獻49-53
• Abstract53-57
• 附錄57-58
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文58-59
• 致謝59

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