本文關(guān)鍵詞：斑馬魚MeCP2的多克隆抗體制備及其對(duì)NOTCH信號(hào)通路的調(diào)控

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【摘要】：目的：構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1/zMe/eCP2(170-223),轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichiacoli, E.coli)感受態(tài)DH5a中誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白GST-zMeCP2(170-223)。經(jīng)純化的融合蛋白GST-zMeCP2(170-223)為抗原免疫新西蘭大白兔(NZW Rabbit)獲得兔抗斑馬魚抗體。甲基化-CpG結(jié)合蛋白2 (methyl-CpG-binding protein 2, MeCP2)基因突變引起進(jìn)行性神經(jīng)疾病-瑞士綜合癥,通過(guò)原位雜交技術(shù)和激光共聚焦顯微技術(shù),利用Notch轉(zhuǎn)基因魚(Tg(Tp 1 bglob:hmgb 1-mCherry))來(lái)研究MeCP2對(duì)斑馬魚神經(jīng)發(fā)育的調(diào)控。方法：(1)斑馬魚MeCP2目的蛋白的表達(dá)和純化及多克隆抗體的制備。選擇斑馬魚MeCP2氨基酸(170-223)對(duì)應(yīng)的基因序列為目的片段,以pEGFP-C1/MeCP2為模板擴(kuò)增目的片段,將目的片段克隆到表達(dá)載體pGEX-4T-1中構(gòu)建重組質(zhì)粒,獲得重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/zMeCP2(170-223)。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR驗(yàn)證和測(cè)序鑒定正確后轉(zhuǎn)化至DH5a中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。將誘導(dǎo)后的菌株用GST瓊脂糖凝膠親和層析純化。SDS-PAGE分析純化蛋白。用純化的蛋白免疫新西蘭大白兔,制備抗血清。(2)兔抗斑馬魚多克隆抗體的驗(yàn)證和功能檢測(cè)：利用斑馬魚、大、小鼠腦組織通過(guò)Western-blot驗(yàn)證。利用免疫共沉淀技術(shù),通過(guò)質(zhì)譜,進(jìn)一步驗(yàn)證MeCP2抗體的特異性及完成對(duì)MeCP2蛋白復(fù)合物的檢測(cè)。運(yùn)用免疫熒光技術(shù)對(duì)MeCP2進(jìn)一步定位。(3)斑馬魚顯微注射和胚胎原位雜交技術(shù)：斑馬魚胚胎發(fā)育在1-2細(xì)胞期注入6 nL的orpholino (MO)或mRNA,對(duì)特定基因的下調(diào)或過(guò)表達(dá)。胚胎收集與固定,4℃過(guò)夜,次日進(jìn)行胚胎脫水,復(fù)水,洗滌,蛋白酶K處理,預(yù)雜交,雜交,封閉,洗滌,染色,胚胎信號(hào)采集。(4)免疫熒光技術(shù)：制備斑馬魚腦組織冷凍切片,封閉,一抗孵育過(guò)夜,熒光二抗避光孵育,含有DAPI的封片劑封片，熒光顯微鏡照相。結(jié)果：(1)以pEGFP-C1/MeCP2為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了162 bp的目的基因,通過(guò)雙酶切和連接,成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/zMe/eCP2(170-223),經(jīng)PCR驗(yàn)證和測(cè)序鑒定目的基因質(zhì)粒構(gòu)建。含pGEX-4T-1/zMeCP2(170-223)的重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo),純化獲得GST-zMeCP2(170-223)融合蛋白。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色,在32 kDa分子量處有特異性條帶與預(yù)期的蛋白分子量相符。以純化的融合蛋白為抗原免疫新西蘭大白兔獲得兔抗斑馬魚MeCP2 (zMeCP2)抗體。(2)考馬斯亮藍(lán)染色顯示,zMeCP2抗體可以識(shí)別斑馬魚MeCP2蛋白,IP-westernblot結(jié)果顯示,zMeCP2抗體能夠富集并特異性識(shí)別大鼠MeCP2蛋白,成年斑馬魚腦組織免疫熒光顯示，，MeCP2蛋白核定位。(3)質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示,多種蛋白分子與MeCP2存在相互作用,有兩種經(jīng)過(guò)Co-IP驗(yàn)證確定,分別是RNA Binding Motif Protein 4(RBM4)和PUR家族。其中PUR家族purA和purB之間能形成穩(wěn)定的復(fù)合物,二者與MeCP2均能形成穩(wěn)定的復(fù)合物。(4)原位雜交和免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示,MeCP2在胚胎發(fā)育過(guò)程前期廣泛表達(dá),隨后逐漸集中表達(dá)在腦部。在Notch轉(zhuǎn)基因魚(Tg(Tplbglob:hmgbl-mCherry))胚胎，Notch在敲低MeCP2的胚胎中的表達(dá)與野生型胚胎相比也明顯降低,再共注射NICD-RNA后,Notch表達(dá)得到恢復(fù)。在敲低MeCP2的胚胎中,標(biāo)志神經(jīng)成熟的神經(jīng)因子Ngn1、Pax2、 Pax3、Eno2、Map和RNA結(jié)合蛋白HUC表達(dá)下調(diào)。靶基因hey2,在敲低MeCP2的胚胎中的表達(dá)與野生型胚胎相比也明顯降低。結(jié)論：(1)成功構(gòu)建了pGEX-4T-1/zMeCP2(170-223)重組表達(dá)質(zhì)粒,表達(dá)純化得到了GST-zMeCP2(170-223)的融合蛋白。(2)表達(dá)純化的zMeCP2(170-223)蛋白能夠刺激兔子產(chǎn)生兔抗斑馬魚的MeCP2多克隆抗體。(3)得到的兔抗斑馬魚MeCP2的多克隆抗體能夠特異性識(shí)別鼠源MeCP2并且可以用來(lái)做免疫共沉淀。(4)質(zhì)譜鑒定出多種與MeCP2目互作用的蛋白,其中可以肯定的有PUR家族和RBM4。(5)PUR家族purA和purB之間能形成穩(wěn)定的復(fù)合物,二者與MeCP2均能形成穩(wěn)定的復(fù)合物。(6) MeCP2在胚胎神經(jīng)發(fā)育前期廣泛表達(dá),敲低MeCP2能延緩胚胎神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育。(7) MeCP2能夠通過(guò)Notch-hey2信號(hào)通路來(lái)調(diào)控斑馬魚神經(jīng)細(xì)胞的分化。
【關(guān)鍵詞】：斑馬魚 MeCP2 多克隆抗體制備 Notch信號(hào)通路
【學(xué)位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R749.94;Q78
【目錄】：

• 摘要7-9
• 主要縮略語(yǔ)英文索引9-10
• 前言10-15
• (1) MeCP2基因和蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)10-11
• (2) MeCP2的功能研究11-12
• (3) 斑馬魚神經(jīng)發(fā)育模型12-13
• (4) Notch信號(hào)通路13-15
• 材料和方法15-29
• 1 材料15-20
• 1.1 斑馬魚品系15
• 1.2 表達(dá)質(zhì)粒15
• 1.3 主要耗材15-20
• 1.3.1 主要儀器15-16
• 1.3.2 主要試劑16-17
• 1.3.3 主要試劑的配制17-20
• 2 方法20-29
• 2.1 抗體制備的技術(shù)路線20
• 2.2 抗原選擇及引物設(shè)計(jì)20-21
• 2.3 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/MeCP2(170-223)構(gòu)建與驗(yàn)證21-22
• 2.3.1 目的基因的獲得21
• 2.3.2 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/zMeCP2(170-223)的構(gòu)建21-22
• 2.3.3 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/zMeCP2(170-223)的驗(yàn)證22
• 2.4 GST-zMeCP2(170-223)融合蛋白的表達(dá)和純化22-23
• 2.4.1 GST-zMeCP2(170-223)融合蛋白表達(dá)條件的摸索22
• 2.4.2 GST-zMeCP2(170-223)融合蛋白的純化22-23
• 2.5 兔抗斑馬魚zMeCP2(170-223)抗體的獲得23
• 2.6 Western檢測(cè)和免疫共沉淀23-24
• 2.6.1 Western檢測(cè)23
• 2.6.2 免疫共沉淀23-24
• 2.7 斑馬魚腦組織冷凍切片的制備及免疫熒光24
• 2.8 斑馬魚的飼養(yǎng)24-25
• 2.9 斑馬魚的顯微注射25-26
• 2.10 斑馬魚胚胎免疫熒光染色26
• 2.11 熒光成像拍攝26
• 2.12 斑馬魚胚胎原位雜交26-29
• 結(jié)果29-44
• 1 PCR擴(kuò)增結(jié)果和重組質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證結(jié)果29-30
• 2 融合蛋白GST-zMeCP2(170-223)的表達(dá)條件摸索及純化結(jié)果30-32
• 3 zMeCP2抗體的IP-western blot分析與免疫熒光32-34
• 4 部分質(zhì)譜鑒定結(jié)果及相關(guān)IP-western blot驗(yàn)證結(jié)果34-35
• 5 MeCP2在斑馬魚神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)35-36
• 6 注射MeCP2-MO斑馬魚表型變化36-37
• 7 注射MeCP2-MO后NOTCH信號(hào)的表達(dá)變化37-39
• 8 敲低MeCP2的胚胎對(duì)神經(jīng)因子表達(dá)影響39-42
• 9 注射MeCP2-MO后轉(zhuǎn)錄抑制因子hey2的表達(dá)變化42-44
• 討論44-47
• 全文結(jié)論47-49
• 參考文獻(xiàn)49-53
• Abstract53-57
• 附錄57-58
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文58-59
• 致謝59

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