本文關(guān)鍵詞：腸道菌群實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立及在喘息急性發(fā)作期兒童中的變化

  更多相關(guān)文章： 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 毛細(xì)支氣管炎 支氣管哮喘 雙歧桿菌 乳酸桿菌

【摘要】：目的：建立利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)人糞便組織中雙歧桿菌、乳酸桿菌含量的方法，為檢測(cè)人腸道內(nèi)菌群提供有效手段。同時(shí)檢測(cè)處于喘息急性發(fā)作期的毛細(xì)支氣管炎和支氣管哮喘兒童糞便內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌含量變化，進(jìn)一步探討腸道菌群與呼吸系統(tǒng)疾病的關(guān)系。 方法：所檢測(cè)的糞便樣本收集自2012年10月-2013年10月在吉林大學(xué)第一醫(yī)院小兒呼吸一科住院的毛細(xì)支氣管炎患兒和在喘息急性發(fā)作期的支氣管哮喘患兒，其中支氣管哮喘組為11例，毛細(xì)支氣管炎組14例，對(duì)照組糞便樣本來自小兒外科因血管瘤、疝氣等擇期手術(shù)的兒童及醫(yī)護(hù)人員子女，共收集25例。提取糞便樣本中細(xì)菌總DNA，選擇細(xì)菌種屬的特異性基因16S rRNA作為擴(kuò)增區(qū)設(shè)計(jì)細(xì)菌特異性引物，以常規(guī)PCR擴(kuò)增出的16S rRNA部分基因片段制作標(biāo)準(zhǔn)品。應(yīng)用SYBR Green Ⅰ雙鏈嵌合染料，對(duì)連續(xù)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣本進(jìn)行分析，建立絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線從而對(duì)樣本中的乳酸桿菌、雙歧桿菌進(jìn)行定量。根據(jù)可檢測(cè)到的標(biāo)準(zhǔn)品最低拷貝數(shù)計(jì)算反應(yīng)靈敏度；分析PCR產(chǎn)物溶解曲線評(píng)價(jià)反應(yīng)特異性；重復(fù)檢測(cè)梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，用相同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值變異系數(shù)（CV）評(píng)價(jià)反應(yīng)穩(wěn)定性。通過應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法對(duì)糞便組織中的雙歧桿菌和乳酸桿菌進(jìn)行絕對(duì)定量，觀察喘息急性發(fā)作期的患兒腸道內(nèi)的雙歧桿菌和乳酸桿菌含量變化，并分別比較毛細(xì)支氣管炎組、支氣管哮喘組與正常對(duì)照組兒童三組間雙歧桿菌和乳酸桿菌含量的差別。應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。 結(jié)果： 1.常規(guī)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出雙歧桿菌和乳酸桿菌16S rRNA部分基因片段測(cè)序結(jié)果正確，成功構(gòu)建了雙歧桿菌和乳酸桿菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中的標(biāo)準(zhǔn)品；生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線r2均大于0.99；雙歧桿菌和乳酸桿菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR最低檢測(cè)限度為分別為每個(gè)反應(yīng)74.4個(gè)拷貝和142個(gè)拷貝；溶解曲線呈單峰；組間相同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值變異系數(shù)小。 2.喘息急性發(fā)作期的支氣管哮喘兒童糞便內(nèi)雙歧桿菌含量與正常對(duì)照組對(duì)比含量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p=0.02；乳酸桿菌含量變化檢測(cè)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p=0.559。 3.毛細(xì)支氣管炎患兒糞便內(nèi)雙歧桿菌含量與正常對(duì)照組對(duì)比含量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，，p=0.036；乳酸桿菌含量變化檢測(cè)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p=0.935。 4.對(duì)檢測(cè)的50例兒童糞便中的雙歧桿菌和乳酸桿菌進(jìn)行相關(guān)性分析，兩者無相關(guān)性，p=0.028，r2=0.097。 結(jié)論： 1.本研究所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)敏感性高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好，適用于對(duì)人糞便中雙歧桿菌和乳酸桿菌含量的檢測(cè)。 2.支氣管哮喘兒童在喘息急性發(fā)作期存在腸道菌群的紊亂，主要表現(xiàn)為糞便內(nèi)雙歧桿菌含量減少，乳酸桿菌的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.毛細(xì)支氣管炎患兒腸道菌群變化趨勢(shì)同支氣管哮喘患兒一致。提示雙歧桿菌含量的減少可能是毛細(xì)支氣管炎演變?yōu)橹夤芟^程中腸道菌群變化的早期靶標(biāo)。 4.同一兒童體內(nèi)的雙歧桿菌和乳酸桿菌分析無相關(guān)性，提示乳酸桿菌和雙歧桿菌無協(xié)同或拮抗作用。
【關(guān)鍵詞】：實(shí)時(shí)熒光定量PCR 毛細(xì)支氣管炎 支氣管哮喘 雙歧桿菌 乳酸桿菌
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R725.6
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 引言11-13
• 第2章 綜述13-17
• 摘要13
• 2.1 哮喘和衛(wèi)生學(xué)假說13-14
• 2.2 腸道菌群研究現(xiàn)狀14-15
• 2.3 腸道菌群與哮喘關(guān)系研究進(jìn)展15-16
• 2.4 展望16-17
• 第3章 資料與方法17-24
• 3.1 研究對(duì)象17
• 3.2 主要試劑及儀器17-18
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法18-23
• 3.4 研究方法23
• 3.5 觀察指標(biāo)23
• 3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理23-24
• 第4章 結(jié)果24-35
• 4.1 糞便基因組的提取結(jié)果24
• 4.2 常規(guī) PCR 方法擴(kuò)增細(xì)菌部分 16S rRNA 基因的結(jié)果24-27
• 4.3 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及評(píng)價(jià)27-29
• 4.4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)效果評(píng)價(jià)29-31
• 4.5 喘息急性發(fā)作期兒童糞便內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌的定量分析結(jié)果31-35
• 第5章 討論35-40
• 第6章 結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-46
• 作者簡(jiǎn)介及在學(xué)期間所取得的科研成果46-47
• 致謝47

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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3 張利利;鄭鵬遠(yuǎn);王新亭;劉志強(qiáng);黃煌;羅予;;雙歧桿菌對(duì)食物過敏小鼠腸道屏障功能及Th1/Th2細(xì)胞因子的影響[J];世界華人消化雜志;2009年11期

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本文編號(hào)：585288