本文關(guān)鍵詞：肺炎支原體外毒素CARDS TX的制備及特性研究

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【摘要】：背景和目的： 最新研究發(fā)現(xiàn)肺炎支原體(Mycoplasma penumoniae, MP)毒力因子--社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征毒素(Community-acquired respiratory distress syndrome toxin, CARDS TX)參與MP侵犯呼吸道等病理生理過(guò)程。CARDS TX是由MP基因MPN372編碼表達(dá)的68KDa蛋白質(zhì),主要分布于MP胞膜表面和胞質(zhì),具有二磷酸腺苷核糖轉(zhuǎn)移酶(ADP-ribosyltransferase, ART)活性,能造成宿主細(xì)胞空泡化,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡,參與了MP肺炎等疾病過(guò)程。因而被認(rèn)為是MP的一個(gè)重要毒力因子,對(duì)其的深入研究可能為MP感染的發(fā)病機(jī)制提供了一個(gè)新的研究方向。 本研究擬在體外重組表達(dá)并純化具有活性的CARDS TX,并制備其兔多克隆抗體。為了更好的闡明CARDS TX的特性以及其在MP感染發(fā)病機(jī)制中的作用,我們進(jìn)一步研究了CARDS TX在人肺腺癌A549細(xì)胞中的定位,對(duì)DNA損傷的影響及對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮RPE細(xì)胞纖毛長(zhǎng)度的影響。 方法： 1.構(gòu)建帶有His-tag的表達(dá)載體Pet28b (+)-CARDS,經(jīng)Ni柱純化得到單一重組的CARDS TX (rCARDS TX). 2.倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)及MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率。 3.免疫熒光法檢測(cè)MP或rCARDS TX處理A549細(xì)胞后CARDS TX在細(xì)胞的分布,及其與MP粘附的關(guān)系。 4.免疫熒光法檢測(cè)γH2AX。 5.免疫熒光法檢測(cè)人視網(wǎng)膜色素上皮RPE細(xì)胞纖毛的長(zhǎng)度。結(jié)果： 1.采用BamHI和Xhol限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定質(zhì)粒PET-28b(+)-CARDS,凝膠電泳可見(jiàn)CARDS TX基因片段大小為1773bp。通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色,純化的rCARDS TX蛋白清晰可見(jiàn)。 2. rCARDS TX處理的細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制,且部分細(xì)胞出現(xiàn)了空泡化,50μg/ml處理組細(xì)胞空泡化嚴(yán)重并導(dǎo)致細(xì)胞死亡,細(xì)胞數(shù)目減少。MTT試驗(yàn)顯示rCARDS TX處理的A549細(xì)胞存活率明顯下降。 3.免疫熒光顯示CARDS TX在A549細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有分布,胰酶處理MP后,CARDS TX在細(xì)胞內(nèi)的分布減少。 4. rCARDS TX處理A549細(xì)胞后細(xì)胞核內(nèi)形成γH2AX焦點(diǎn)。 5.MP或rCARDS TX處理RPE細(xì)胞后,纖毛長(zhǎng)度明顯下降。結(jié)論： 1.成功的構(gòu)建Pet28(+)-CARDS表達(dá)載體,并純化出具有活性的rCARDS TX. 2.在MP或rCARDS TX處理的A549細(xì)胞中,CARDS TX在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有分布,并且與MP的黏附力有關(guān),當(dāng)MP黏附力下降時(shí),CARDS TX在細(xì)胞內(nèi)的分布減少。 3.rCARDS TX和MP均可引起細(xì)胞DNA的損傷。 4.MP和rCARDS TX均可導(dǎo)致RPE細(xì)胞纖毛長(zhǎng)度變短。
【關(guān)鍵詞】：肺炎支原體 毒素 粘附 DNA損傷 纖毛
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R725.6
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 中英文縮略詞10-12
• 目次12-13
• 1 引言13-17
• 2 材料與方法17-35
• 2.1 主要材料和試劑17-23
• 2.2 主要實(shí)驗(yàn)方法23-35
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-45
• 3.1 重組質(zhì)粒PET-28b(+)-CARDS的酶切鑒定35-36
• 3.2 CARDS TX在大腸桿菌BL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)及純化36-37
• 3.3 CARDS TX生物活性的驗(yàn)證37-39
• 3.4 CARDS TX在A549細(xì)胞內(nèi)的分布及與MP粘附的關(guān)系39-41
• 3.5 rCARDS TX誘導(dǎo)γH2AX焦點(diǎn)形成41-43
• 3.6 MP和rCARDS TX致RPE細(xì)胞纖毛長(zhǎng)度變短43-45
• 4. 討論45-49
• 5. 結(jié)論49-50
• 6. 不足和進(jìn)一步工作展望50-51
• 參考文獻(xiàn)51-57
• 綜述57-67
• 參考文獻(xiàn)64-67
• 作者簡(jiǎn)歷及在學(xué)期間所取得的科研成果67-68

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 陽(yáng)愛(ài)梅;宋建輝;黃榕;金世杰;楊萍;;1026例兒童肺炎支原體感染及耐藥情況分析[J];中國(guó)當(dāng)代兒科雜志;2013年07期

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本文編號(hào)：553820