本文關(guān)鍵詞：miR-375過表達(dá)對心肌樣細(xì)胞增殖、凋亡和分化的影響

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【摘要】：心臟是胚胎發(fā)育過程中最早形成的器官,其間涉及許多相關(guān)基因依時空順序差次表達(dá)以及多條信號通路(如Notch信號通路、BMP信號通路、Wnt信號通路等)的精確調(diào)控,以保證心肌細(xì)胞的正確遷移、增殖以及分化。其中,任意基因的異常都有可能導(dǎo)致先天性心臟病的發(fā)生。先天性心臟病是新生兒期最常見的先天畸形之一,發(fā)病率高達(dá)0.8%~1%,是導(dǎo)致人類孕期流產(chǎn)、死胎和新生兒發(fā)育缺陷甚至死亡的主要原因之一,嚴(yán)重危害著人類的健康和生存質(zhì)量,給家庭和社會帶來巨大的負(fù)擔(dān)。因此,從基因和分子水平探索胚胎心臟形成及發(fā)育機(jī)制成為防治先天性心臟病基礎(chǔ)研究新方向之一。MicroRNA(mi RNA)是一類長約22 nt的非編碼小RNA,通過與靶基因mRNA的3’UTR區(qū)域結(jié)合,介導(dǎo)mRNA降解或抑制其轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá),導(dǎo)致靶標(biāo)蛋白表達(dá)降低,從而參與并調(diào)控時序發(fā)育、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、激素分泌等生理過程及多種疾病發(fā)生過程,其表達(dá)水平的變化與疾病的發(fā)生密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)miRNAs無論是在細(xì)胞增殖、分化,還是在生物發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展過程中均發(fā)揮重要作用,因而引起了研究人員越來越多的關(guān)注。有關(guān)研究表明,miRNA不僅參與了心臟發(fā)育與心肌重構(gòu),并且在心臟疾病的發(fā)生發(fā)展中起著一定作用。本研究小組前期通過生物芯片技術(shù)篩選發(fā)現(xiàn),miR-375基因在室間隔缺損胚胎心肌組織中的表達(dá)豐度顯著高于正常人工流產(chǎn)胚胎心肌組織,隨后我們采用實(shí)時熒光定量PCR驗證了這一結(jié)果;另外我們還發(fā)現(xiàn)miR-375在先天性心臟病胎兒的孕母(妊娠18-22周)血液中也呈現(xiàn)高表達(dá),提示miR-375很有可能在胚胎心臟發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。但miR-375致胚胎心臟發(fā)育畸形的功能與機(jī)制研究目前并無文獻(xiàn)報道。鑒于P19細(xì)胞和斑馬魚是心臟發(fā)育分子機(jī)制研究的經(jīng)典模型,本研究借助上述模型,通過改變miR-375表達(dá)水平,探討了miR-375過表達(dá)對P19細(xì)胞增殖、凋亡、分化的影響,評價了其在斑馬魚胚胎心臟發(fā)育中的功能,并初步分析了miR-375下游作用的靶標(biāo),為先天性心臟病發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)研究提供新線索。第一部分mir-375過表達(dá)對p19細(xì)胞增殖、凋亡的影響目的:構(gòu)建mir-375過表達(dá)質(zhì)粒,篩選出穩(wěn)定過表達(dá)mir-375的p19細(xì)胞株,研究mir-375對p19細(xì)胞增殖、凋亡的影響;獲得mir-375過表達(dá)影響斑馬魚胚胎心臟發(fā)育的表型。方法:構(gòu)建mir-375過表達(dá)質(zhì)粒,與gfp(greenfluorescentprotein,綠色熒光蛋白)對照載體分別轉(zhuǎn)染p19細(xì)胞,嘌呤霉素篩選兩周,熒光觀察和qrt-pcr驗證篩選出穩(wěn)定表達(dá)mir-375的細(xì)胞株。cck-8檢測細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期;并用hoechst染色、流式細(xì)胞計數(shù)分析、實(shí)時熒光定量pcr等技術(shù),檢測bax/bcl-2表達(dá)水平;westemblot法檢測凋亡過程中蛋白水平的變化,以評價mir-375對p19細(xì)胞凋亡的影響;斑馬魚單細(xì)胞期顯微注射mir-375minics觀察mir-375對胚胎心臟形態(tài)學(xué)的影響。結(jié)果:mir-375過表達(dá)抑制了p19細(xì)胞的增殖;抑制p19細(xì)胞進(jìn)入s期,凋亡相關(guān)的bax/bcl-2比值增高,細(xì)胞凋亡增加;mir-375過表達(dá)可致斑馬魚胚胎發(fā)育出現(xiàn)心包水腫等心臟畸形表型。結(jié)論:mir-375過表達(dá)能夠影響p19細(xì)胞的增殖與凋亡功能,并致斑馬魚胚胎發(fā)育出現(xiàn)心包水腫等心臟畸形表型。第二部分miR-375過表達(dá)對P19細(xì)胞分化和Notch信號通路的影響目的:研究mi R-375過表達(dá)對P19細(xì)胞分化、Notch信號通路的影響。方法:誘導(dǎo)穩(wěn)定過表達(dá)miR-375的P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化,實(shí)時熒光定量PCR檢測心肌細(xì)胞分化過程中心肌特異性標(biāo)記物GATA4、cTnT、Mef2c的變化以及Notch信號通路相關(guān)因子在分化過程中的表達(dá)變化,Westem blot法檢測分化過程中相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。熒光素酶驗證Notch2是否是miR-375的下游靶標(biāo)。結(jié)果:miR-375過表達(dá)可抑制P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化,心肌標(biāo)記物的表達(dá)量在細(xì)胞分化過程中逐漸升高,但就某一分化點(diǎn)而言,心肌標(biāo)記物表達(dá)量在miR-375過表達(dá)組中較對照組低;Notch2是miR-375的下游靶標(biāo),miR-375過表達(dá)可能通過抑制Notch信號通路進(jìn)而影響P19細(xì)胞的分化。結(jié)論:mi R-375過表達(dá)可能通過影響Notch信號通路,影響P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化。
【關(guān)鍵詞】：miR-375 P19細(xì)胞 增殖 凋亡 分化 Notch信號通路
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R725.4
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 前言11-14
• 第一部分 miR-375過表達(dá)對P19細(xì)胞增殖、凋亡的影響14-40
• 材料與方法14-29
• 結(jié)果29-37
• 討論37-40
• 第二部分 miR-375過表達(dá)對P19細(xì)胞分化和Notch信號通路的影響40-54
• 材料與方法40-47
• 結(jié)果47-52
• 討論52-54
• 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-61
• 綜述61-74
• 參考文獻(xiàn)67-74
• 縮略語74-75
• 攻讀碩士期間發(fā)表文章情況75-76
• 附錄76-79
• 致謝79-80

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