發(fā)布時(shí)間：2017-06-21 18:09

  本文關(guān)鍵詞：膠體金免疫層析法聯(lián)合檢測(cè)EV71和CA16 IgM的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景 手足口病(Hand foot and mouth disease, HFMD)的主要致病原為腸道病毒71型(Enterovirus71, EV71)和柯薩奇病毒A組16型(Coxsackie A16, CA16)。近年來,HFMD發(fā)病率在全球呈逐年上升趨勢(shì),引起全球特別是我國(guó)政府和醫(yī)療體系的高度關(guān)注。但臨床缺乏早期快速簡(jiǎn)便高靈敏度的診斷方法,不能及時(shí)有效診斷疾病,常造成重大疫情,嚴(yán)重影響了人民健康和社會(huì)穩(wěn)定。所以,尋找簡(jiǎn)便快速的床旁快速檢測(cè)是目前手足口病防控研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。 目的 建立膠體金免疫層析捕獲法聯(lián)合檢測(cè)EV71和CA16IgM試紙條。 方法 1. EV71-VP1重組蛋白的表達(dá)優(yōu)化：將pET-41b(+)-VP1轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中,制備重組菌。初步誘導(dǎo)表達(dá)后,經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測(cè),當(dāng)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致時(shí),采用單因素變量法分別進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化,選擇最適條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。 2. EV71-VP1重組蛋白的純化：表達(dá)產(chǎn)物通過Streamline DEAE和Streamline Chelating進(jìn)行純化獲得高純度蛋白。 3.試紙條的初步制備與檢測(cè)：以實(shí)驗(yàn)室同類試紙條制備方法制備試紙條并檢測(cè)。試紙條以EV71-VP1和CA16-VP1抗原分別作檢測(cè)線1、檢測(cè)線2,以羊抗鼠IgG多克隆抗體作質(zhì)控線,膠體金標(biāo)記鼠抗人IgMμ鏈抗體。 4.工藝優(yōu)化：通過對(duì)膠體金粒徑、標(biāo)記pH、蛋白標(biāo)記量、蛋白包被量、膠體金保護(hù)液配方、加入量和硝酸纖維素膜的優(yōu)化選擇,從而對(duì)試紙條的性能進(jìn)行優(yōu)化。 5.對(duì)試紙條性能進(jìn)行評(píng)價(jià)：從試紙條的特異性、靈敏度、精密性、穩(wěn)定性、重復(fù)性對(duì)試紙條性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。 結(jié)果 1.高效表達(dá)并純化獲得EV71-VP1抗原：通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定BL21(DE3)/EV71-VP1的最適誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時(shí)間；SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白表觀分子量為30KDa-40KDa; Western blot檢測(cè)證實(shí)重組抗原具有較好的特異性和良好的抗原性；純化復(fù)性后獲得蛋白量21.6mg,純度達(dá)96.5%。 2.初步制備了膠體金免疫層析捕獲法聯(lián)合檢測(cè)EV71和CA16IgM試紙條。確定EV71-VP1抗原和CA16-VP1抗原的最適包被濃度,標(biāo)記抗體濃度。靈敏度、特異性、精密性、重復(fù)性好。37℃放置5周試紙條性能穩(wěn)定。 結(jié)論 1.經(jīng)原核表達(dá)和純化成功獲得了重組蛋白EV71-VP1,并制備用于檢測(cè)早期EV71和CA16感染的膠體金免疫層析試紙條； 2.建立了采用雙波長(zhǎng)掃描檢測(cè)膠體金穩(wěn)定性選擇標(biāo)記pH的方法。
【關(guān)鍵詞】：膠體金免疫層析 腸道病毒71型病毒 柯薩奇病毒A組16型病毒 手足口病
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R446.6;R725.1
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 第一部分 前言11-14
• 第二部分 材料和方法14-37
• 第三部分 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-50
• 第四部分 討論50-53
• 第五部分 小結(jié)53-54
• 參考文獻(xiàn)54-61
• 文獻(xiàn)綜述61-68
• 參考文獻(xiàn)66-68
• 附錄68-69
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況69-70
• 致謝70-71
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷71

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：膠體金免疫層析法聯(lián)合檢測(cè)EV71和CA16 IgM的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：469492