目的:獲得塵螨變應(yīng)原第6組分Der f 6原核表達產(chǎn)物并檢測其與塵螨過敏性哮喘患兒血清抗體IgE結(jié)合率。方法:酶切質(zhì)粒p ET28a(+)-Der f 6獲得目的基因Der f 6,將其與p ET32a(+)載體連接成質(zhì)粒p ET32a(+)-Der f 6,轉(zhuǎn)化BL21細菌后,用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達,用Ni+離子親和層析柱純化表達產(chǎn)物,用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、免疫印跡實驗(Western blot)和蛋白質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF)鑒定純化產(chǎn)物。以純化獲得的產(chǎn)物為包被抗原建立間接ELISA法檢測塵螨過敏性哮喘患兒血清抗體反應(yīng)情況。結(jié)果:成功構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒p ET32a(+)-Der f 6,將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21誘導(dǎo)表達,親和層析純化后,SDS-PAGE顯示獲得目的蛋白,Western blot驗證其能夠與載體的組氨酸標簽結(jié)合,質(zhì)譜鑒定其Der f 6結(jié)構(gòu)一致。以此產(chǎn)物為包被抗原建立間接ELISA檢測塵螨過敏性哮喘患兒血清,陽性率為41.3%(19/46)。結(jié)論:成功構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒p ET32a(+)...

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圖1質(zhì)粒pET28a(+)-Derf6經(jīng)BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切電泳圖

圖2pET32a(+)-Derf6菌落PCＲ鑒定產(chǎn)物電泳圖

狣erf6結(jié)構(gòu)一致。2.3融合蛋白ELISA檢測結(jié)果以純化獲得的pET32a(+)-Derf6原核表達產(chǎn)物為包被抗原進行ELISA檢測，5健康體檢合格兒童血清抗體的OD值為0.199，標準差為0.0159，以(0.199+3×0.019)=0.258為閾值，46份塵螨過敏性哮喘患....

圖3SDS-PAGE和Westernblot驗證純化后pET32a(+)-Derf6原核表達產(chǎn)物

圖3SDS-PAGE和Westernblot驗證純化后pET32a(+)-Derf6原核表達產(chǎn)物Fig．3SDS-PAGEanalysisandWesternblotanalysisofexpressedproductsofpET32a(+)-Derf6inE-.coliBL21....

圖4純化后的pET32a(+)-Derf6原核表達產(chǎn)物IgE反應(yīng)性

圖3SDS-PAGE和Westernblot驗證純化后pET32a(+)-Derf6原核表達產(chǎn)物Fig．3SDS-PAGEanalysisandWesternblotanalysisofexpressedproductsofpET32a(+)-Derf6inE-.coliBL21....

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