本文關(guān)鍵詞：內(nèi)皮祖細(xì)胞Notch4信號(hào)通路在川崎病模型冠脈損傷及修復(fù)中作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景： 川崎病(Kawasaki disease),是一種自限性全身血管炎性綜合征,為5歲以下嬰幼兒的急性發(fā)熱出疹性疾病,屬于自身免疫炎癥性疾病。由日本兒科醫(yī)師Tomisaku Kawasaki在1967年首先報(bào)道,開始以為是罕見疾病,但目前川崎病已取代風(fēng)濕熱成為許多國家(亞裔國家多見)嬰幼兒和兒童獲得性心臟病的首要病因,也是我國常見的成人心血管疾病的病因之一。病程中內(nèi)皮細(xì)胞壞死、脫落可以導(dǎo)致血管內(nèi)膜受損、平滑肌層和膠原暴露、血小板凝聚,上述病理過程進(jìn)而加重了炎癥反應(yīng),使血管壁結(jié)構(gòu)完整性被破壞,最終致冠脈狹窄或阻塞,甚至冠狀動(dòng)脈瘤。 內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial Progenitor Cells, EPCs)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,能夠在內(nèi)源性或(和)外源性刺激因素作用下促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)和血管新生,能夠維持血管內(nèi)皮完整性,從而維持血流動(dòng)力學(xué)的穩(wěn)定。組織缺血缺氧或內(nèi)皮損傷時(shí),骨髓EPCs被動(dòng)員至外周血,通過增殖、遷移、歸巢、分化整合至內(nèi)皮缺損部位,參與血管損傷的修復(fù)以及微血管生成過程。促進(jìn)EPCs的增殖、動(dòng)員及分化,增加外周血循環(huán)EPCs的數(shù)量,將是冠狀動(dòng)脈損傷治療的新方向。而目前關(guān)于內(nèi)皮祖細(xì)胞的定義,生物學(xué)特性,動(dòng)員、遷移、歸巢及分化的具體過程及詳細(xì)機(jī)制都不甚清楚或者存在很大爭議。 Notch4信號(hào)介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊在心血管發(fā)育及修復(fù)過程中有重要作用,Notch4信號(hào)通路是維持造血干細(xì)胞以及EPCs等細(xì)胞未分化狀態(tài)的關(guān)鍵。EPCs表面存在Notch4受體,與相應(yīng)配體結(jié)合后能夠促進(jìn)EPCs增殖、分化及動(dòng)靜脈轉(zhuǎn)化等過程,在血管生成與修復(fù)中起重要調(diào)控作用,因此Notch4信號(hào)在EPCs生物活性調(diào)控和增殖、分化成熟中起到關(guān)鍵作用。 鑒于川崎病病因及發(fā)病機(jī)制仍不明確,而川崎病患幾EPCs狀態(tài)的臨床研究有限,且受到細(xì)胞間相互作用、藥物干預(yù)及倫理學(xué)等多方面問題的制約,我們無法深入研究EPCs的真實(shí)狀態(tài)。因此,本研究通過干酪乳桿菌細(xì)胞壁萃取物(LCWE)免疫刺激構(gòu)建小鼠川崎病冠狀動(dòng)脈病變模型,檢測小鼠骨髓EPCs含量及otch4的表達(dá),同時(shí)進(jìn)行體外培養(yǎng),研究川崎病冠狀動(dòng)脈損傷時(shí),EPCs的含量、Notch4的表達(dá)及EPCs功能的改變,以及在mRNA和蛋白水平上Notch4及其下游信號(hào)RBP-Jκ的表達(dá)變化。 目的： 通過LCWE誘導(dǎo)川崎病冠脈損傷的小鼠模型,在其不同病程階段探究骨髓EPCs含量、Notch4的表達(dá)和EPCs功能的改變及Notch4-RBP-Jκ信號(hào)通路在川崎病冠脈損傷及修復(fù)中的作用。 方法： 第一部分：小鼠骨髓EPCs的培養(yǎng)及功能檢測與鑒定 1.用干酪乳桿菌制備干酪乳桿菌細(xì)胞壁萃取物(LCWE)。 2. BALB/C品系雄性小鼠,通過單次腹腔注射LCWE,建立小鼠川崎病冠狀動(dòng)脈損傷模型。 3.用密度梯度離心法獲取小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞,用EGM-2培養(yǎng)7天后進(jìn)行相關(guān)檢測。 4.細(xì)胞增殖活力檢測：用CCK試劑盒檢測細(xì)胞增殖活力,用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度,并計(jì)算其活力。 5.細(xì)胞粘附能力檢測：用胰酶消化細(xì)胞,并重新接種于24孔板內(nèi),置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30min后,PBS沖洗后顯微鏡下計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞。 6.細(xì)胞遷移能力檢測：用插入式Transwell24孔板檢測細(xì)胞遷移能力,在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。 7.體外血管形成能力：將EPCs接種于ECMatrix膠上,置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),并于4、6、8、10、12h在顯微鏡下觀察小(血)管生成情況。 8.免疫熒光 (1)免疫雙熒光鑒定：用DiI-acLDL和FITC-UEA-I孵育細(xì)胞,用DAPI染核,于激光共聚焦顯微鏡下觀察。 (2) RBP-Jκ和VEGFR-2免疫熒光檢測：分別用RBP-Jκ和VEGFR-2抗體孵育細(xì)胞,用DAPI染核,于激光共聚焦顯微鏡下觀察。 第二部分：檢測川崎病不同病程階段小鼠骨髓EPCs含量和Notch4的表達(dá) 1.分別取LCWE腹腔注射后3d,7d,14d,28d的小鼠及對等時(shí)間的對照組小鼠,分離出骨髓單個(gè)核細(xì)胞,用CD34-eFluro660, Notch4-PE, Flk-1-FITC, CD45-Percp-cy5.5標(biāo)記細(xì)胞,用流式細(xì)胞術(shù)檢測EPCs和Notch4(+)EPC的含量。 2.體外培養(yǎng)小鼠骨髓EPCs7天后,用胰酶消化細(xì)胞,制備細(xì)胞懸液,同樣用流式細(xì)胞術(shù)檢測EPCs和Notch4(+) EPC的含量。 第三部分：熒光定量PCR檢測NOTCH4. RBP-Jκ信號(hào)通路、及內(nèi)皮相關(guān)因子P-Selectin. VCAM-1的mRNA的表達(dá) 定量PCR檢測體外培養(yǎng)的小鼠骨髓EPCs的NOTCH4、RBP-Jκ、P-Selectin、 VCAM-1在mRNA水平的表達(dá)。 第四部分：Western Blot檢測體外培養(yǎng)的小鼠骨髓EPCs的RBP-Jκ、 VEGFR-2蛋白的表達(dá) 提取體外培養(yǎng)的小鼠骨髓EPCs的總蛋白,經(jīng)過SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,孵育一抗、二抗,加化學(xué)發(fā)光底物顯色,顯影等步驟,獲得蛋白表達(dá)的影像,掃描并分析蛋白條帶灰度值。 結(jié)果： 第一部分：體外培養(yǎng)的小鼠骨髓EPCs的功能檢測與鑒定 1.體外培養(yǎng)的川崎病小鼠模型骨髓EPCs集落形成能力顯著降低。 2.體外培養(yǎng)的川崎病小鼠模型骨髓EPCs的增殖活力明顯低于對照組。 3.體外培養(yǎng)的川崎病小鼠模型骨髓EPCs的粘附能力明顯低于對照組。 4.體外培養(yǎng)的川崎病小鼠模型骨髓EPCs的遷移能力明顯低于對照組。 5.體外培養(yǎng)的川崎病小鼠模型骨髓EPCs的體外血管形成能力能力明顯低于對照組。 6.免疫熒光 (1)免疫雙熒光鑒定：各LCWE處理組雙陽性率明顯低于對照組。 (2) RBP-J κ陽性表達(dá)率：LCWE處理組在3d組、7d組、14d組明顯低于對照組。 (3) VEGFR-2陽性表達(dá)率：LCWE處理組在3d組、7d組、14d組明顯低于對照組。 第二部分：小鼠骨髓EPCs的含量和Notch4的表達(dá) 1.取骨髓單個(gè)核細(xì)胞直接流式檢測結(jié)果：各LCWE處理組的EPCs含量明顯低于對照組。而LCWE處理組在3d組、7d組、14組Notch4(+) EPCs含量卻明顯高于對照組,28d組Notch4(+) EPCs含量雖然也高于對照組,但差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.體外培養(yǎng)的川崎病小鼠模型骨髓EPCs含量明顯低于對照組。而Notch4(+) EPCs含量卻明顯高于對照組。 第三部分：體外培養(yǎng)的小鼠骨髓EPCs的NOTCH4、RBP-Jκ、P-Selectin、 VCAM-1的mRNA水平 1. NOTCH4mRNA:3d組LCWE處理組的mRNA表達(dá)水平明顯低于對照組。 2. RBP-Jκ mRNA:3d、7d組LCWE處理組的mRNA表達(dá)水平明顯低于對照組。 3. P-Selectin mRNA:3d組LCWE處理組的mRNA表達(dá)水平明顯低于對照組。 4. VCAM-1mRNA:各LCWE處理組與對照組差異均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 第四部分：體外培養(yǎng)的小鼠骨髓EPCs的RBP-Jκ和VRGFR-2蛋白的表達(dá) 1. RBP-Jκ蛋白：3d組LCWE處理組RBP-Jκ蛋白表達(dá)明顯低于對照組。 2. VRGFR-2蛋白：各LCWE處理組與對照組差異均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1.川崎病小鼠模型的骨髓EPCs數(shù)量明顯減少。 2.川崎病小鼠模型的骨髓EPCs的各項(xiàng)功能和生物活性嚴(yán)重受損。 3. Notch4-RBP-Jκ信號(hào)通路參與了川崎病冠脈損傷及修復(fù),其具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：川崎病 骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞 Notch4 RBP-Jκ VEGFR-2 LCWE
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R725.4
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-10
• Abstract10-16
• 英文縮寫詞與中英文索引16-17
• 目次17-18
• 1 引言18-22
• 2 材料與方法22-35
• 3 結(jié)果35-46
• 4 討論46-50
• 5 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-56
• 綜述56-89
• 參考文獻(xiàn)71-89
• 作者簡歷及在學(xué)期間所取得的科研成果89

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 徐明國;門麗娜;王海霞;祖瑩;趙春玉;趙霞;蔡華波;孟祥春;王濤;;川崎病患兒循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能與血漿超敏C反應(yīng)蛋白濃度的關(guān)系[J];中國當(dāng)代兒科雜志;2010年07期

2 徐明國;門麗娜;祖瑩;趙春玉;孟祥春;;人血丙種球蛋白和阿司匹林治療對川崎病患兒循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響[J];中國當(dāng)代兒科雜志;2011年12期

3 Stefano Capobianco;Venu Chennamaneni;Mayank Mittal;;Endothelial progenitor cells as factors in neovascularization and endothelial repair[J];World Journal of Cardiology;2010年12期

  本文關(guān)鍵詞：內(nèi)皮祖細(xì)胞Notch4信號(hào)通路在川崎病模型冠脈損傷及修復(fù)中作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：375923