病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是兒科臨床常見的心血管系統(tǒng)疾病之一，其臨床表現(xiàn)各異，在急性期，輕者可以沒有癥狀，重者可發(fā)生心力衰竭、心源性休克、室性快速性心律失常，甚至猝死，部分遷延不愈者會最終演變成擴(kuò)張性心肌病，嚴(yán)重威脅身體健康。二十世紀(jì)七十年代以來，VMC的發(fā)病日趨增多，國內(nèi)外許多學(xué)者以柯薩奇B組病毒(Coxsackieviruses group B，CVB)建立了VMC的動物模型或細(xì)胞模型，從免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等方面探討VMC的發(fā)病機(jī)制，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，故研究其發(fā)病機(jī)理，為臨床治療提供理論依據(jù)是當(dāng)前心血管科研工作者研究的熱點。 VMC的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，目前比較明確的是病毒對心肌細(xì)胞的直接損傷作用和機(jī)體感染病毒后所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)對心肌細(xì)胞的殺傷作用。但其確切的機(jī)制尚未完全闡明。有研究表明病毒對心肌細(xì)胞離子通道的作用可能參與和／或加重病毒對心肌細(xì)胞的損傷。鉀離子通道在所有離子通道中占據(jù)重要地位，它在遺傳上或功能上都具有多樣性，在維持膜靜息電位，膜興奮性以及膜復(fù)極化速率等方面起著關(guān)鍵性的作用，已成為心血管疾病醫(yī)學(xué)研究的熱門課題和醫(yī)藥發(fā)展的主攻方向。近年來國內(nèi)外研究表明，在心肌梗塞后、高血壓性肥大心肌及慢性心力衰竭或慢性心律失常等成人多見疾病中鉀離子通道基因的mRNA水平發(fā)生了改變，但對其在病毒性心肌炎中的改變尚未見報道。 浙三工大學(xué)博士學(xué)位論文 尋找治療VMC的有效藥物一直是臨床工作人員和科研工作者的關(guān)注點。國 內(nèi)研究表明，多種中草藥在病毒性心肌炎的治療中取得較好的效果，特別對心肌 炎的慢性階段有良好的療效。近年來的研究表明:蘆丁可明顯抑制胞膜脂質(zhì)氧化 酶，有效地保護(hù)心肌細(xì)胞膜的完整性，從而對缺糖缺氧和缺血后再灌注損傷的心 肌細(xì)胞有良好的保護(hù)作用。但迄今尚未見有關(guān)蘆丁是否對病毒感染的心肌細(xì)胞有 保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)理的報道。 本研究選用體外培養(yǎng)的新生SD大鼠心肌細(xì)胞，建立嗜心性CVB(my。carditiC CvB3，CvBam)感染心肌細(xì)胞的模型，觀察病毒感染后心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化、 培養(yǎng)上清中鉀離子濃度改變及心肌細(xì)胞膜上電壓門控鉀離子通道Kvl .2、Kvl .5、 Kv2.1、Kv4.2基因的mRNA水平和Kvl.5、Kv4.2蛋白水平的改變，以蘆丁千預(yù) 后，觀察這些指標(biāo)的相應(yīng)改變，從離子通道的角度來探討VMC的發(fā)病機(jī)理、心律 失常發(fā)生機(jī)制和蘆丁的作用機(jī)制。 第一部分SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)、 病毒性心肌炎模型的建立 用分步胰酶消化法獲取SD大鼠乳鼠的心肌細(xì)胞，采用差速貼壁法和BrdU 抑制法提純心肌細(xì)胞。在心肌細(xì)胞培養(yǎng)滿48小時后，隨機(jī)把細(xì)胞分成二組:正 常對照組和病毒感染組。在病毒感染組中添加含ZooTeIDS。CVB3。的RpMll640培 養(yǎng)基，對照組僅加培養(yǎng)基，37℃溫育2小時后，各組棄上清，以Hank’S液沖洗 后加培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)觀察，每2一3天換液，觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并 分別在病毒感染后24小時、72小時、120小時抽取上清送檢心肌酶AST、LDH、 CK一MB。 結(jié)果 1.倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)、搏動的觀察:孵育24小時時乳鼠心肌細(xì)胞均已 貼壁，呈梭形，有少量分叉，折光性強(qiáng)，細(xì)胞之間沒有完全融合，細(xì)胞開始出現(xiàn) 緩慢小幅搏動，孵育48小時后心肌細(xì)胞折光性更強(qiáng)，分叉增多，融合成團(tuán)，呈 菊花狀，100%心肌細(xì)胞以40~120次/分鐘的頻率搏動，同團(tuán)細(xì)胞為同步搏動， 浙會工大學(xué)博士學(xué)位論文 非同團(tuán)細(xì)胞絕大多數(shù)為同步搏動，有個別為非同步搏動。病毒感染后48小時內(nèi) 心肌細(xì)胞的外形無明顯改變，但搏動頻率有所下降，并出現(xiàn)非同步搏動增多，至 72小時后，感染細(xì)胞搏動明顯減少甚至停止搏動，出現(xiàn)病變細(xì)胞:折光性下降， 細(xì)胞變圓，變暗，成團(tuán)，破壞，可發(fā)現(xiàn)影子細(xì)胞(ghos七cen)(細(xì)胞體積明顯 增大，內(nèi)容物減少，細(xì)胞核未見)，CPE在(+)~(+++)之間，至120小時， 非感染細(xì)胞仍同步搏動，而感染細(xì)胞幾乎全部停止搏動，細(xì)胞灰暗，成團(tuán)，細(xì)胞 間隙增寬，培養(yǎng)上清中漂浮物增多。 2.病毒感染后細(xì)胞培養(yǎng)上清中心肌酶AST、LDH、CK一MB的變化:病毒感染 24小時，培養(yǎng)上清中心肌酶AST、LDH、CK一MB水平在對照組與感染組之間均沒 有顯著性差異(P0.05)，在72小時、120小時，感染組的心肌酶AST、LDH、CK一MB 水平均升高，與對照組比較有顯著(P0.05)或極顯著差異(Pq.01)o各組在 72小時、120小時時間點與本組24小時時間點進(jìn)行配對T檢驗，對照組心肌酶 AST、CK一MB沒有顯著改變(P)0.05)，LDH有極顯著降低(P(0.01);感染組各心 肌酶則均有極顯著升高(P0.01)。 第二部分培養(yǎng)心肌細(xì)胞感染病毒后電壓門控鉀離子通道表達(dá)的改變 同第一部分培養(yǎng)心肌細(xì)胞和建立心肌細(xì)胞病毒感染模型后，在病毒感染24 小時、72小時、120小時點各抽取培養(yǎng)上清lml送檢上清中K+，在120小時點 終止細(xì)胞培養(yǎng)，抽取細(xì)胞的總RNA和細(xì)胞膜總蛋白，分別用RT一PcR和Western blotting法鋇(定心肌細(xì)胞的電壓門控鉀離子通道Kvl.2、Kvl.5、Kv2.1、Kv4.2的 mRNA和Kvl.5、Kv4.2的蛋白水平。 結(jié)果 1.病毒感染后培養(yǎng)上清中I{+的變化:病毒感染組在病
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R725.4
【部分圖文】：

RT-PCR法測定鉀浦遣&v1.2,Rv1.5;%v2.1,%v4.2的.味目石水平兒naxkerC:對照組I:感染組

ITKVZ.l圖3一122、K節(jié)1。5、:感染組KVZ.1、KV4。2K誠.枷F】萬A的影響T:千預(yù)組巧kD，呻吟味份州甲扮一神呼護(hù)甲C1TC1TCIT圖3一14蘆丁對心肌細(xì)胞鉀離子通道Kvl.5蛋白的影響c:對照組工:感染組T:治療組7。勺.甘勸目皿可卜匆臺，.口CITCIT圖3一巧蘆丁對心肌細(xì)胞鉀離子通道Kv生.2蛋白的影響C:對照組工:感染組T:治療組

—口一a心七丘nTCIT.2Kvl.5丁對心肌細(xì)胞鉀離子通道Kvl.爪，麗arkerC:對照組工ITKVZ.l2、K節(jié)1。5、:感染組KVZ.1、KV4。2K誠.枷F】萬A的影響T:千預(yù)組呻吟味份州甲扮一神呼護(hù)甲1TC1TCIT3一14蘆丁對心肌細(xì)胞鉀離子通道Kvl.5蛋白的影響c:對照組工:感染組T:治療組勺.甘勸目皿可卜匆臺，.口CITCIT3一巧蘆丁對心肌細(xì)胞鉀離子通道Kv生.2蛋白的影響C:工:T:
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