目的: 許多研究表明,男性生殖系統(tǒng)分化和發(fā)育異常明顯增加,大多數(shù)與睪丸發(fā)育、下降不全相關(guān),而睪丸引帶與睪丸發(fā)育、下降關(guān)系密切。人類胰島素樣因子3(INSL3)基因廣泛存在,其表達(dá)的蛋白多肽是胰島素樣家族激素的一部分,是睪丸經(jīng)腹下降階段的主要調(diào)節(jié)激素,對(duì)睪丸引帶的發(fā)育起決定性作用。但到目前為止,關(guān)于INSL3影響睪丸引帶發(fā)育的機(jī)制尚未研究清楚。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)體外培養(yǎng)小鼠睪丸引帶細(xì)胞,利用不同濃度INSL3直接作用于培養(yǎng)的小鼠睪丸引帶細(xì)胞,研究INSL3對(duì)培養(yǎng)小鼠睪丸引帶細(xì)胞增殖和收縮活性的影響,以探討INSL3影響睪丸下降的可能機(jī)理。 方法: 脫頸椎處死3d大雄性昆明小鼠,消毒后正中剪開下腹部,再次辨認(rèn)雌雄,在3倍手術(shù)放大鏡下于膀胱兩側(cè)完整游離出睪丸、附睪及睪丸引帶,置于PBS中剔出大部分睪丸引帶組織。將引帶組織放入含Ⅰ型膠原酶(1mg/ml)的DMEM培養(yǎng)液中,37℃持續(xù)震蕩消化1小時(shí)后,加入3-4倍含無(wú)雌激素血清的培養(yǎng)液終止消化作用,1500r/min離心濾液5min,棄上清。將細(xì)胞沉淀加入含無(wú)雌激素胎牛血清(10%v/v)DMEM培養(yǎng)基,接種于25cm~2培養(yǎng)瓶中,置于5% CO_2、37℃飽和濕度孵育箱中靜置培養(yǎng)。根據(jù)不同的檢測(cè)要求,將貼壁的睪丸引帶細(xì)胞以6×10~4/ml密度的細(xì)胞懸液(Ⅰ代細(xì)胞或者Ⅱ代細(xì)胞)分別傳代接種到6孔板、96孔板以及培養(yǎng)瓶中,并用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法確定細(xì)胞存活率,血清濃度為5%培養(yǎng)。細(xì)胞接種約24小時(shí)后,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(INSL3 0.02ng/ml、0.20ng/ml、2.00ng/ml、20.00ng/ml)、正常對(duì)照組細(xì)胞。加藥后,INSL3作用不同時(shí)間獲取標(biāo)本,分別采用HE染色、CCK-8、免疫熒光以及流式細(xì)胞分析術(shù)等方法檢測(cè)小鼠睪丸引帶細(xì)胞增殖以及F-actin的表達(dá)情況。 結(jié)果: 1.原代培養(yǎng)的小鼠睪丸引帶細(xì)胞大部分為成纖維樣細(xì)胞,有少數(shù)上皮樣細(xì)胞生長(zhǎng),呈放射狀、火焰狀或漩渦狀走行,胞體呈梭形、不規(guī)則形或三角形,胞質(zhì)有突起。傳代后細(xì)胞仍呈成纖維細(xì)胞型生長(zhǎng),同源性好,存活率約為90%。 2. CCK-8方法發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組細(xì)胞呈持續(xù)性增殖,于培養(yǎng)24h后增殖越趨明顯。與正常對(duì)照組增殖趨勢(shì)類似,實(shí)驗(yàn)組加藥后12h即存在增殖(P0.05),但12h與24h相比差異不明顯(P0.05),48h出現(xiàn)明顯差異(P0.05)。與正常對(duì)照組相比,不同劑量組在12h無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),而24h與48h情況則不同:24h時(shí)2.00ng/ml、20.00ng/ml組與正常對(duì)照組相比均有差異(P0.05),48h時(shí)0.20ng/ml、2.00ng/ml、20.00ng/ml組與正常對(duì)照組相比均有顯著差異,其余劑量組差異不明顯(P0.05)。 3.免疫熒光顯示正常對(duì)照組的F-actin主要分布在細(xì)胞周邊,形成周邊肌動(dòng)蛋白絲帶,胞漿內(nèi)可見(jiàn)少量短而細(xì)的應(yīng)力纖維。INSL3刺激引起細(xì)胞骨架重塑,細(xì)胞周邊肌動(dòng)蛋白絲帶增多,且胞漿中微絲F-actin明顯粗大、變長(zhǎng),大多為較長(zhǎng)的粗大應(yīng)力絲,沿細(xì)胞縱軸排列較多。在20.00ng/ml組變化尤其明顯,呈一定的劑量和時(shí)間相關(guān)性。 4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)F-actin蛋白顯示INSL3作用24h后0.02ng/ml、0.20ng/ml組平均熒光強(qiáng)度與正常對(duì)照組相比有所下降,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),2.00ng/ml組與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),20.00ng/ml組平均熒光強(qiáng)度明顯高于正常對(duì)照組(P0.05);48h后20.00ng/ml組平均熒光強(qiáng)度明顯高于正常對(duì)照組(P0.05),其余各劑量組與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同一劑量組,48h與24h相比有下降趨勢(shì),其中0.02ng/ml組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),而0.20ng/ml、2.00ng/ml、20.00ng/ml組均有差異(P0.05)。 結(jié)論: 1.培養(yǎng)小鼠睪丸引帶細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞型生長(zhǎng),傳代后細(xì)胞同源性好,存活率高。 2. CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示INSL3對(duì)小鼠睪丸引帶細(xì)胞增殖有顯著的促進(jìn)作用,呈劑量-時(shí)間效應(yīng)。 3. F-actin的檢測(cè)結(jié)果從形態(tài)學(xué)以及蛋白定量分析方面均提示INSL3可能通過(guò)增強(qiáng)小鼠睪丸引帶細(xì)胞的收縮來(lái)影響睪丸引帶的發(fā)育,進(jìn)而影響睪丸的正常下降。
【學(xué)位單位】：汕頭大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類】：R726.9
【部分圖文】：

細(xì)胞低密度呈扁平單層細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)密度增加趨于融合時(shí)，細(xì)胞形態(tài)變得細(xì)長(zhǎng)。大部分為成纖維細(xì)胞，有少數(shù)的上皮樣細(xì)胞。細(xì)胞呈放射狀、火焰狀或漩渦狀走行，胞體呈梭形、不規(guī)則形或三角形，胞質(zhì)有突起。原代細(xì)胞培養(yǎng)約需 6～8d 達(dá) 80％融合時(shí)傳代。傳代培養(yǎng)：傳代后細(xì)胞仍呈成纖維細(xì)胞型生長(zhǎng)，同源性好。臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率約為 90％。2 培養(yǎng)睪丸引帶細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察2.1 倒置顯微鏡觀察睪丸引帶細(xì)胞大部分為成纖維細(xì)胞，有少數(shù)的上皮樣細(xì)胞。細(xì)胞呈放射狀、火焰狀或漩渦狀走行，胞體呈梭形或不規(guī)則形或三角形，胞質(zhì)有突起。原代原代、I 代和 II 代睪丸引帶細(xì)胞在形態(tài)上無(wú)區(qū)別。

圖 2 培養(yǎng)睪丸引帶細(xì)胞 HE 染色結(jié)果 (A：×100；B：×200；C：×400)顯示睪丸引帶細(xì)胞大部分呈成纖維細(xì)胞型，具有高度的同源性。3 INSL3 對(duì)睪丸引帶細(xì)胞增殖性的影響（CCK-8 法）不同劑量的 INSL3 作用后三個(gè)不同的時(shí)間段對(duì)細(xì)胞增殖性的檢測(cè)結(jié)果如圖 3 和表1。結(jié)果顯示：正常對(duì)照組細(xì)胞呈持續(xù)性增殖，于培養(yǎng) 24h 后增殖越趨明顯。與正常對(duì)照組增殖趨勢(shì)類似，實(shí)驗(yàn)組加藥后 12h 即存在增殖（P<0.05），但 12h 與 24h 相比差異不明顯（P>0.05），48h 出現(xiàn)明顯差異（P<0.05）。與正常組相比，不同劑量組在 12h 無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），而 24h 與 48h 情況則不同：24h 時(shí) 2.00ng/ml、20.00ng/ml 組與正常對(duì)照組相比均有差異（P<0.05），48h 時(shí) 0.20ng/ml、2.00ng/ml、20.00ng/ml 組與正常對(duì)照組相比均有顯著差異，其余劑量組差異不明顯（P>0.05）。

Blank Control Normal Control 0.02ng/ml 0.20ng/ml 2.00ng/ml 20.00nh 0.0088±0.0018△△*0.0708±0.0147*0.0673±0.0095*0.0678±0.0092 0.0725±0.0038*0.0713±h 0.0003±0.0027△△0.1082±0.0315 0.1045±0.0110 0.1092±0.0208 0.0972±0.0146*0.1002±h 0.0022±0.0024△△0.1138±0.0102 0.1190±0.0152 0.1172±0.0217 0.1402±0.0107△0.1314±h 0.0000±0.0051△△0.2480±0.0344*0.3378±0.0473*0.4207±0.0227△△*0.5891±0.0272△△*0.6690±0藥后同一時(shí)間段內(nèi)各組與正常對(duì)照組的比較，△: P <0.05,△△: P <0.01；同一組別內(nèi)各時(shí)4h 的比較, *: P <0.05。ompared with the Normal Control group at the same time, △ : P <0.05,△ △: P <0.01; compared wie same group, *: P <0.05.
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本文編號(hào)：2874881