目的: 許多研究表明,男性生殖系統(tǒng)分化和發(fā)育異常明顯增加,大多數(shù)與睪丸發(fā)育、下降不全相關,而睪丸引帶與睪丸發(fā)育、下降關系密切。人類胰島素樣因子3(INSL3)基因廣泛存在,其表達的蛋白多肽是胰島素樣家族激素的一部分,是睪丸經(jīng)腹下降階段的主要調(diào)節(jié)激素,對睪丸引帶的發(fā)育起決定性作用。但到目前為止,關于INSL3影響睪丸引帶發(fā)育的機制尚未研究清楚。本實驗擬通過體外培養(yǎng)小鼠睪丸引帶細胞,利用不同濃度INSL3直接作用于培養(yǎng)的小鼠睪丸引帶細胞,研究INSL3對培養(yǎng)小鼠睪丸引帶細胞增殖和收縮活性的影響,以探討INSL3影響睪丸下降的可能機理。 方法: 脫頸椎處死3d大雄性昆明小鼠,消毒后正中剪開下腹部,再次辨認雌雄,在3倍手術放大鏡下于膀胱兩側完整游離出睪丸、附睪及睪丸引帶,置于PBS中剔出大部分睪丸引帶組織。將引帶組織放入含Ⅰ型膠原酶(1mg/ml)的DMEM培養(yǎng)液中,37℃持續(xù)震蕩消化1小時后,加入3-4倍含無雌激素血清的培養(yǎng)液終止消化作用,1500r/min離心濾液5min,棄上清。將細胞沉淀加入含無雌激素胎牛血清(10%v/v)DMEM培養(yǎng)基,接種于25cm~2培養(yǎng)瓶中,置于5% CO_2、37℃飽和濕度孵育箱中靜置培養(yǎng)。根據(jù)不同的檢測要求,將貼壁的睪丸引帶細胞以6×10~4/ml密度的細胞懸液(Ⅰ代細胞或者Ⅱ代細胞)分別傳代接種到6孔板、96孔板以及培養(yǎng)瓶中,并用臺盼藍染色計數(shù)法確定細胞存活率,血清濃度為5%培養(yǎng)。細胞接種約24小時后,隨機分為實驗組(INSL3 0.02ng/ml、0.20ng/ml、2.00ng/ml、20.00ng/ml)、正常對照組細胞。加藥后,INSL3作用不同時間獲取標本,分別采用HE染色、CCK-8、免疫熒光以及流式細胞分析術等方法檢測小鼠睪丸引帶細胞增殖以及F-actin的表達情況。 結果: 1.原代培養(yǎng)的小鼠睪丸引帶細胞大部分為成纖維樣細胞,有少數(shù)上皮樣細胞生長,呈放射狀、火焰狀或漩渦狀走行,胞體呈梭形、不規(guī)則形或三角形,胞質(zhì)有突起。傳代后細胞仍呈成纖維細胞型生長,同源性好,存活率約為90%。 2. CCK-8方法發(fā)現(xiàn)正常對照組細胞呈持續(xù)性增殖,于培養(yǎng)24h后增殖越趨明顯。與正常對照組增殖趨勢類似,實驗組加藥后12h即存在增殖(P0.05),但12h與24h相比差異不明顯(P0.05),48h出現(xiàn)明顯差異(P0.05)。與正常對照組相比,不同劑量組在12h無統(tǒng)計學差異(P0.05),而24h與48h情況則不同:24h時2.00ng/ml、20.00ng/ml組與正常對照組相比均有差異(P0.05),48h時0.20ng/ml、2.00ng/ml、20.00ng/ml組與正常對照組相比均有顯著差異,其余劑量組差異不明顯(P0.05)。 3.免疫熒光顯示正常對照組的F-actin主要分布在細胞周邊,形成周邊肌動蛋白絲帶,胞漿內(nèi)可見少量短而細的應力纖維。INSL3刺激引起細胞骨架重塑,細胞周邊肌動蛋白絲帶增多,且胞漿中微絲F-actin明顯粗大、變長,大多為較長的粗大應力絲,沿細胞縱軸排列較多。在20.00ng/ml組變化尤其明顯,呈一定的劑量和時間相關性。 4.流式細胞儀檢測F-actin蛋白顯示INSL3作用24h后0.02ng/ml、0.20ng/ml組平均熒光強度與正常對照組相比有所下降,均有統(tǒng)計學差異(P0.05),2.00ng/ml組與正常對照組相比無統(tǒng)計學差異(P0.05),20.00ng/ml組平均熒光強度明顯高于正常對照組(P0.05);48h后20.00ng/ml組平均熒光強度明顯高于正常對照組(P0.05),其余各劑量組與正常對照組相比無統(tǒng)計學差異。同一劑量組,48h與24h相比有下降趨勢,其中0.02ng/ml組無統(tǒng)計學差異(P0.05),而0.20ng/ml、2.00ng/ml、20.00ng/ml組均有差異(P0.05)。 結論: 1.培養(yǎng)小鼠睪丸引帶細胞呈成纖維細胞型生長,傳代后細胞同源性好,存活率高。 2. CCK-8檢測結果顯示INSL3對小鼠睪丸引帶細胞增殖有顯著的促進作用,呈劑量-時間效應。 3. F-actin的檢測結果從形態(tài)學以及蛋白定量分析方面均提示INSL3可能通過增強小鼠睪丸引帶細胞的收縮來影響睪丸引帶的發(fā)育,進而影響睪丸的正常下降。
【學位單位】：汕頭大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2011
【中圖分類】：R726.9
【部分圖文】：

細胞低密度呈扁平單層細胞，細胞生長密度增加趨于融合時，細胞形態(tài)變得細長。大部分為成纖維細胞，有少數(shù)的上皮樣細胞。細胞呈放射狀、火焰狀或漩渦狀走行，胞體呈梭形、不規(guī)則形或三角形，胞質(zhì)有突起。原代細胞培養(yǎng)約需 6～8d 達 80％融合時傳代。傳代培養(yǎng)：傳代后細胞仍呈成纖維細胞型生長，同源性好。臺盼藍染色檢測細胞存活率約為 90％。2 培養(yǎng)睪丸引帶細胞形態(tài)學觀察2.1 倒置顯微鏡觀察睪丸引帶細胞大部分為成纖維細胞，有少數(shù)的上皮樣細胞。細胞呈放射狀、火焰狀或漩渦狀走行，胞體呈梭形或不規(guī)則形或三角形，胞質(zhì)有突起。原代原代、I 代和 II 代睪丸引帶細胞在形態(tài)上無區(qū)別。

圖 2 培養(yǎng)睪丸引帶細胞 HE 染色結果 (A：×100；B：×200；C：×400)顯示睪丸引帶細胞大部分呈成纖維細胞型，具有高度的同源性。3 INSL3 對睪丸引帶細胞增殖性的影響（CCK-8 法）不同劑量的 INSL3 作用后三個不同的時間段對細胞增殖性的檢測結果如圖 3 和表1。結果顯示：正常對照組細胞呈持續(xù)性增殖，于培養(yǎng) 24h 后增殖越趨明顯。與正常對照組增殖趨勢類似，實驗組加藥后 12h 即存在增殖（P<0.05），但 12h 與 24h 相比差異不明顯（P>0.05），48h 出現(xiàn)明顯差異（P<0.05）。與正常組相比，不同劑量組在 12h 無統(tǒng)計學差異（P>0.05），而 24h 與 48h 情況則不同：24h 時 2.00ng/ml、20.00ng/ml 組與正常對照組相比均有差異（P<0.05），48h 時 0.20ng/ml、2.00ng/ml、20.00ng/ml 組與正常對照組相比均有顯著差異，其余劑量組差異不明顯（P>0.05）。

Blank Control Normal Control 0.02ng/ml 0.20ng/ml 2.00ng/ml 20.00nh 0.0088±0.0018△△*0.0708±0.0147*0.0673±0.0095*0.0678±0.0092 0.0725±0.0038*0.0713±h 0.0003±0.0027△△0.1082±0.0315 0.1045±0.0110 0.1092±0.0208 0.0972±0.0146*0.1002±h 0.0022±0.0024△△0.1138±0.0102 0.1190±0.0152 0.1172±0.0217 0.1402±0.0107△0.1314±h 0.0000±0.0051△△0.2480±0.0344*0.3378±0.0473*0.4207±0.0227△△*0.5891±0.0272△△*0.6690±0藥后同一時間段內(nèi)各組與正常對照組的比較，△: P <0.05,△△: P <0.01；同一組別內(nèi)各時4h 的比較, *: P <0.05。ompared with the Normal Control group at the same time, △ : P <0.05,△ △: P <0.01; compared wie same group, *: P <0.05.
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本文編號：2874881