前言 支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)是采用機械通氣或氧氣治療早產(chǎn)兒急性呼吸衰竭后并發(fā)的慢性肺疾病(chronic lung disease，CLD)，是威脅早產(chǎn)兒健康和生命的首要疾病。隨著圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，極低出生體重兒的成活率明顯提高，BPD的發(fā)病率也在不斷上升，其病理特點由過去顯著的肺間質(zhì)纖維化轉(zhuǎn)變?yōu)橐苑闻莺脱馨l(fā)育阻滯為突出特征。 氧中毒是導(dǎo)致BPD的一個重要原因。將新生動物暴露于高濃度氧(高氧)環(huán)境，可以成功建立BPD的動物模型。過去人們對BPD的研究熱點多集中在肺間質(zhì)纖維化和肺泡發(fā)育受阻方面，對于BPD預(yù)防和治療一直沒有突破性進(jìn)展。近來，血管的異常變化在肺發(fā)育阻滯中的作用日益受到人們的關(guān)注。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是調(diào)節(jié)肺血管生長的重要因子，VEGF基因療法或重組人VEGF可促進(jìn)高氧暴露大鼠肺臟毛細(xì)血管形成，改善肺泡發(fā)育。 促炎因子和抗炎因子的調(diào)控失衡在BPD的發(fā)病機制中占有重要地位。單核細(xì)胞趨化蛋白—1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)和中性粒細(xì)胞趨化因子-1(cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1，CINC-1)基因的上調(diào)與BPD氧化應(yīng)激導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)有關(guān)。一定程度上抑制二者的表達(dá)可以減輕高氧肺損傷，降低BPD的發(fā)病率。 近年來，促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)抗氧化、抗感染、抗凋亡及促進(jìn)血管生成等作用備受關(guān)注。少數(shù)動物實驗發(fā)現(xiàn)，EPO可能對BPD有一定防治作用，但機制尚未進(jìn)一步闡明。目前對EPO和VEGF之間作用關(guān)系的研究存在分歧。EPO在炎癥反應(yīng)中具有類固醇激素樣的抗炎作用：EPO可以減輕缺血再灌注肺損傷肺內(nèi)中性粒細(xì)胞聚集、肺水腫和血清TNF-α的表達(dá)。EPO可以減輕缺氧缺血性腦損傷大鼠腦組織白細(xì)胞浸潤和IL-1β的升高。 本研究擬從EPO促進(jìn)血管生成和抗炎作用方面，探討EPO促進(jìn)肺微血管形成的作用機制及其與VEGF之間的相互作用關(guān)系，探討EPO在抑制高氧炎癥反應(yīng)中對CINC-1和MCP-1的作用，完善BPD的發(fā)病機制，為BPD的預(yù)防和治療提供一個新思路。 實驗材料與方法 一、動物模型 新生Wistar大鼠生后12h之內(nèi)隨機分為4組：Ⅰ．空氣對照，Ⅱ．空氣+重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythropoietin，rhEPO)，Ⅲ．高氧對照，Ⅳ．高氧+rhEPO。Ⅲ、Ⅳ組置于玻璃氧箱中，持續(xù)輸入氧氣，F(xiàn)iO_2=0.85±0.02(美國OM-25ME型測氧儀監(jiān)測)。用鈉石灰吸收CO_2，使其濃度0.5％(Dapex氣體分析儀)，溫度22～25℃，濕度60％～70％。每天定時開箱15min，添水、飼料及更換墊料，并與空氣對照組交換母鼠以免因氧中毒而致喂養(yǎng)能力下降。Ⅰ、Ⅱ組吸入空氣，具體方法及實驗因素同Ⅲ、Ⅳ組。Ⅱ、Ⅳ組于生后0d高氧暴露前30分鐘和生后2d給rhEPO 1200IU/kg背部皮下注射，Ⅰ、Ⅲ組給予等量生理鹽水注射。 二、標(biāo)本的采集和處理 于實驗后3、7及14d各組隨機選取8只稱重，5％哥拉麻醉，取左肺1mm~3置于2.5％戊二醛中固定，用于電鏡觀察。經(jīng)氣管緩慢注入10％中性甲醛至右肺，然后置于10％中性甲醛中，4℃過夜，石蠟包埋，制作5μm組織切片，用于肺形態(tài)學(xué)觀察免疫組織化學(xué)檢測。或于麻醉后，右心室采血，置于抗凝管中，行血紅細(xì)胞、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積和血小板檢測；剪開左心耳，經(jīng)右心室插管至肺動脈，注入10ml生理鹽水洗凈肺內(nèi)殘血，收集肺組織，置于無RNase的Eppendorf管中，液氮速凍，-80℃冰箱保存，用于Western blotting，RT-PCR和生化檢測。支氣管肺泡灌洗：動物麻醉后，分離氣管，插入套管針，經(jīng)氣管緩慢注入0.5ml冷生理鹽水，輕輕回抽，反復(fù)4次，匯集每次回收液，4000rpm離心10min，將上清保存在-80℃冰箱用于生化分析。 三、實驗方法 (一)用壽命表法估計每組大鼠生存率行生存分析。 (二)血液紅細(xì)胞、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積和血小板檢測。 (三)肺形態(tài)學(xué)觀察：1．病理。2．輻射狀肺泡計數(shù)(radical alveolar counts，RAC)。3．Masson染色。4．透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)。 (四)肺組織血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(platelet endothelial cell adhensive-1，PECAM-1)、促紅細(xì)胞生成素受體(erythropoietin receptor，EPOR)、VEGF和MCP-1免疫組化檢測。 (五)Western-blot法檢測肺組織PECAM-1、EPOR、VEGF和MCP-1蛋白表達(dá)。 (六)RT-PCR法檢測肺組織EPOR、CINC-1和MCP-1表達(dá)。 (七)支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)總蛋白、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)含量以及肺組織MPO含量檢測。 四、統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示。采用壽命表法進(jìn)行生存分析，生存率比較采用Wilconxon(Gehan)檢驗。各組比較采用One-Way ANOVA，兩兩比較采用SNK(q)檢驗和LSD法。相關(guān)分析采用Spearman分析。 結(jié)果 一、一般狀態(tài)和生存率 Ⅲ組生后7d體重增長低于Ⅰ組，14d差異更明顯(P0.01，P0.001)，Ⅳ組體重與Ⅰ組比較無差異。Ⅳ組生存率明顯高于Ⅲ組(P0.05) 二、血液紅細(xì)胞、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積和血小板的變化 Ⅱ組紅細(xì)胞、血紅蛋白和紅細(xì)胞壓積于7d和14d均高于Ⅰ組(P0.05，P0.01，P0.001)，Ⅲ組紅細(xì)胞、血紅蛋白和紅細(xì)胞壓積于14d明顯低于Ⅰ組(P0.01，P0.001)，Ⅳ組紅細(xì)胞、血紅蛋白和紅細(xì)胞壓積于14d均高于Ⅲ組(P0.05，P0.01)，與Ⅰ組無差異。各組血小板無明顯改變。 三、肺形態(tài)學(xué)改變 (一)肺組織病理變化：Ⅰ組14d肺泡大小均勻一致，肺泡間隔較薄，肺泡毛細(xì)血管豐富，Ⅱ組14d血管增生明顯。Ⅲ組3d肺毛細(xì)血管擴張、充血，間隔少量炎性細(xì)胞浸潤；7d間隔有大量炎細(xì)胞浸潤，肺泡腔有滲出，肺灶狀出血；14d肺泡和毛細(xì)血管數(shù)量減少，形成肺大泡，間隔增厚，肺間質(zhì)膠原沉積。Ⅳ組病理改變明顯減輕。 (二)RAC值變化：Ⅰ、Ⅱ組RAC值隨日齡增加而增加。Ⅲ組RAC值7d時降低(p0.05)，14d更顯著(p0.001)。Ⅳ組RAC值在7d與Ⅰ組無差異，14d時高于Ⅲ組，但仍低于Ⅰ組(p0.001)。 (三)肺內(nèi)膠原沉積的變化：Ⅲ組14d Masson染色肺間質(zhì)藍(lán)色膠原沉積增多。Ⅳ組未見間質(zhì)膠原增多。 (四)超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果：Ⅰ、Ⅱ組血管豐富，血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)完整，基底膜連續(xù)，血氣屏障結(jié)構(gòu)清晰。Ⅲ組：3d血管基底膜有部分增厚、斷裂。7d毛細(xì)血管明顯減少，遠(yuǎn)離肺泡腔，血管基底膜增厚，血管腔被炎細(xì)胞堵塞，肺間質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞浸潤增多，成纖維細(xì)胞增生，Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞固縮，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞出現(xiàn)凋亡小體。14d毛細(xì)血管稀少，氣血屏障明顯增厚，間質(zhì)成纖維細(xì)胞增多，彈力纖維、膠原纖維大量沉積，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞可見萎縮、壞死。Ⅳ組14d血管較Ⅲ組豐富，偶見Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞體積增大及Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞萎縮，成纖維細(xì)胞增生。 四、BALF總蛋白和MPO含量及肺組織MPO的變化 Ⅲ組BALF總蛋白3d增加，7d最顯著(P0.001)。Ⅳ組總蛋白含量明顯降低(P0.05，P0.001)。BALF和肺組織MPO的變化與BALF總蛋白的變化規(guī)律一致。在3d、7d和14d，各組BALF與肺組織MPO呈正相關(guān)(r=0.561，p0.001；r=0.882，p0.001；r=0.656，p0.001)。 五、PECAM-1、EPOR、VIEGF和MCP-1蛋白表達(dá)的變化 Ⅱ組14d PECAM-1蛋白表達(dá)略高于Ⅰ組(P0.05)。Ⅲ組7d和14d PECAM-1蛋白表達(dá)減低(P0.001)。Ⅳ組PECAM-1表達(dá)較Ⅲ組增加，7d與Ⅰ組無差異，14d高于Ⅲ組(P0.001)，低于Ⅰ組。Ⅲ組EPOR表達(dá)減弱(P0.05，P0.001)；Ⅳ組表達(dá)有所增強，3d EPOR表達(dá)與Ⅰ、Ⅱ組無明顯差異，7d、14d時雖高于高氧組，但仍低于正常組(P0.001)。Ⅲ組7dVEGF表達(dá)減低，14d明顯(P0.001)；Ⅳ組VEGF表達(dá)顯著增加(P0.001)。Ⅲ組MCP-1表達(dá)增加，7天達(dá)峰值(P0.001)。Ⅳ組MCP-1含量明顯減低(P0-001)。 六、EPOR、MCP-1和CINC-1mRNA表達(dá)的變化 EPOR和MCP-1mRNA的表達(dá)與其蛋白質(zhì)表達(dá)的變化一致。MCP-1和CINC-1mRNA在Ⅲ組呈高表達(dá)，7d最強(P0.001)。Ⅳ組MCP-1和CINC-1 mRNA表達(dá)較Ⅲ組減弱(P0.05，P0.01，P0.001)。3d、7d和14d各組肺組織MPO與MCP-1mRNA及CINC-1 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.628，P0.001；r=0.841，P0.001；r=0.72，P0.001)(r=0.723，P0.001；r=0.884，P0.001；r=0.697，P0.001)。 結(jié)論 1．慢性高氧(FiO_2=0.85)誘導(dǎo)的新生鼠BPD模型符合早產(chǎn)兒BPD的發(fā)生、發(fā)展特點和組織病理學(xué)改變。 2．EPO能減輕高氧導(dǎo)致的肺部炎癥反應(yīng)，改善高氧導(dǎo)致的肺泡和微血管發(fā)育阻滯，對高氧導(dǎo)致BPD有一定保護(hù)作用。 3．EPO可能是通過上調(diào)高氧致BPD大鼠EPOR表達(dá)，促進(jìn)肺微血管的重建，從而改善肺發(fā)育。 4．VEGF水平降低在BPD發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，EPO通過增加高氧暴露肺組織VEGF表達(dá)，改善肺微血管的發(fā)育，對BPD有一定預(yù)防和保護(hù)作用。 5．由高氧導(dǎo)致的早期炎癥反應(yīng)在BPD發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，BALF中MPO含量可以作為反應(yīng)肺炎性損傷的程度的觀測指標(biāo)。EPO能明顯減輕高氧致BPD早期炎性損傷。 6．細(xì)胞因子CINC-1和MCP-1的表達(dá)調(diào)控著高氧致BPD早期炎細(xì)胞的趨化和聚集，EPO通過下調(diào)MCP-1和CINC-1的表達(dá)減輕肺損傷。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2007
【中圖分類】：R722.12
【部分圖文】：

組14d肺組織一俐田(x200)

1組14d肺組織一H以x200)

11組3d肺組織司皿(xZoo)
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 全裕鳳,常立文,張國風(fēng),馬麗亞;重組人類促紅細(xì)胞生成素對早產(chǎn)大鼠高氧肺損傷的影響[J];中國當(dāng)代兒科雜志;2001年05期

本文編號：2871505