第一部分發(fā)育期驚厥性腦損傷后海馬miRNA差異表達譜分析 目的篩選發(fā)育期驚厥性腦損傷后海馬差異表達的miRNAs,為進一步探討miRNA在發(fā)育期驚厥性腦損傷發(fā)生機制中的作用提供依據(jù)。 方法健康清潔20日齡SD大鼠16只,隨機分為正常對照組和驚厥組,每組8只大鼠。三氟乙醚反復(fù)吸入(每天一次,連續(xù)6天)制作發(fā)育期驚厥模型,對照組除不吸入三氟乙醚外,其他處理同驚厥組。反復(fù)驚厥后1d大鼠斷頭取腦,分離海馬組織,提取總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄,TaqMan(?) MicroRNA Array方法篩選出驚厥組與對照組大鼠海馬差異表達的miRNAs,并利用實時定量PCR對部分差異表達的miRNAs進行二次驗證。 結(jié)果TaqMan(?) MicroRNA Array檢測發(fā)現(xiàn)有30個miRNAs在驚厥組和對照組海馬組織中表達差異顯著,差異倍數(shù)大于2倍以上。其中9個miRNAs上調(diào),21個miRNAs下調(diào)。上調(diào)顯著的miRNAs有：miR-34b-5p、miR-204等；下調(diào)顯著的有miR-582-3p,miR-672等。實時定量PCR對差異表達的miR-34b-5p、miR-204、miR-582-3p、miR-672進行驗證,結(jié)果與TaqMan低密度芯片結(jié)果趨勢一致,表明芯片結(jié)果可靠,提示miR-34b-5p、miR-204等miRNAs參與了發(fā)育期驚厥性腦損傷的發(fā)生過程。 結(jié)論MiR-34b-5p、miR-204等部分miRNAs在發(fā)育期驚厥組和正常對照海馬組織中存在顯著差異表達,提示它們可能參與了發(fā)育期驚厥性腦損傷發(fā)生的分子機制。 第二部分MicroRNA-34b-5p及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bag、 Caspase-3在驚厥后海馬的動態(tài)表達及意義 目的研究發(fā)育期大鼠反復(fù)驚厥后海馬組織miR-34b-5p及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的動態(tài)表達變化,探討miR-34b-5p在發(fā)育期驚厥性腦損傷后海馬神經(jīng)細胞凋亡中的作用。 方法96只20日齡健康Sprague-Dawley (SD)大鼠隨機分為2組：正常對照組和驚厥組。通過三氟乙醚反復(fù)吸入(連續(xù)6次,每天1次)制作發(fā)育期大鼠驚厥動物模型。用qRT-PCR方法檢測反復(fù)驚厥后2h、6h、Id、3d、7d海馬組織中miR-34b-5p的表達；Western Blot方法檢測海馬組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達。 結(jié)果(1)實時定量PCR結(jié)果顯示,反復(fù)驚厥后2h-1d海馬miR-34b-5p的表達均較對照組顯著增高(P0.01),3d、7d時逐漸恢復(fù)至正常水平(P0.05)。(2) Western blot結(jié)果顯示,反復(fù)驚厥后2h大鼠海馬Bcl-2蛋白水平與對照組相比無顯著變化(P0.05),6h較對照組顯著降低,1d時進一步下調(diào),7d時下降最顯著(P0.01)；而反復(fù)驚厥后Bax、Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白的表達呈現(xiàn)相反的趨勢,反復(fù)驚厥后2h大鼠海馬Bax、Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白水平較對照組顯著升高,6h表達量更高,1d時升高最明顯,3d、7d時仍顯著高于對照組(P0.01); Bax/Bcl-2的比值在反復(fù)驚厥后各時間點皆顯著高于對照組(P0.01)。 結(jié)論反復(fù)驚厥后早期海馬miR-34b-5p的表達顯著增強,同時伴有促凋亡相關(guān)基因Bax, Caspase-3活性蛋白的表達增強,Bax/Bcl-2的比值升高,而抗凋亡基因Bcl-2蛋白的表達降低,提示miR-34b-5p可能在發(fā)育期驚厥性腦損傷后早期神經(jīng)細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。 第三部分MicroRNA-34b-5p的靶基因預(yù)測及驗證 目的預(yù)測并驗證miR-34b-5p作用的靶基因,進一步了解miR-34b-5p的生物學(xué)功能及在發(fā)育期驚厥性腦損傷中的作用機制。 方法利用靶基因預(yù)測軟件分析得到miR-34b-5p作用的靶基因。構(gòu)建野生型靶基因3'-UTR和變型靶基因3'-UTR熒光素酶報告基因載體,將這兩個載體分別與miR-34b-5p mimics或miR-34b-5p陰性載體(miR-34b-5p m NC)共同轉(zhuǎn)染海馬星形膠質(zhì)細胞,雙熒光素酶報告基因分析檢測熒光素酶活性變化以證實該靶基因是否為miR-34b-5p作用的靶基因。 結(jié)果(1)軟件預(yù)測Bcl-2基因為miR-34b-5p作用的靶基因。(2)與轉(zhuǎn)染miR-34b-5p m NC相比,共轉(zhuǎn)染miR-34b-5p mimics和野生型Bcl-23'-UTR的熒光素酶活性顯著下降,而轉(zhuǎn)染突變型Bcl-23'-UTR的熒光素酶活性則無明顯變化,證實Bcl-2基因是miR-34b-5p直接作用的靶基因。 結(jié)論成功構(gòu)建了野生型和突變型Bcl-23'-UTR熒光素酶報告基因載體；軟件預(yù)測并經(jīng)熒光素酶報告基因檢測證實Bcl-2基因是miR-34b-5p直接作用的靶基因。 第四部分MicroRNA-34b-5p對驚厥后海馬星形膠質(zhì)細胞凋亡的影響及其機制 目的研究miR-34b-5p對驚厥后海馬星形膠質(zhì)細胞凋亡的影響,闡明miR-34b-5p調(diào)控驚厥后海馬星形膠質(zhì)細胞凋亡的可能機制。 方法(1)原代分離培養(yǎng)大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞,以海人酸干預(yù)誘導(dǎo)細胞驚厥。應(yīng)用TUNEL染色檢測不同濃度海人酸對海馬星形膠質(zhì)細胞凋亡的影響,確定后續(xù)實驗海人酸處理用濃度。并以實時定量PCR檢測海人酸干預(yù)后海馬星形膠質(zhì)細胞miR-34b-5p表達水平的改變,Western Blot檢測凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達水平的改變。(2)利用脂質(zhì)體將miR-34b-5p模擬物(miR-34b-5p mimics)、miR-34b-5p抑制劑(miR-34b-5p inhibitors)以及相對應(yīng)的陰性對照(miR-34b-5p m NC、miR-34b-5p i NC)瞬時轉(zhuǎn)染海馬星形膠質(zhì)細胞,實時定量PCR檢測轉(zhuǎn)染前后miR-34b-5p的表達。并檢測海人酸誘導(dǎo)驚厥后海馬星形膠質(zhì)細胞凋亡及凋亡相關(guān)指標(biāo)的變化。Bcl-2mRNA的表達用實時定量PCR檢測：海馬星形膠質(zhì)細胞的凋亡用TUNEL染色進行檢測；凋亡相關(guān)指標(biāo)Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達用Western Blot檢測。(3)分別將control siRNA、Bcl-2siRNA、miR-34b-5p inhibitors以及Bcl-2siRNA+miR-34b-5p inhibitors轉(zhuǎn)染海馬星形膠質(zhì)細胞,并用海人酸進行干預(yù),Western Blot檢測Bcl-2沉默后對海馬星形膠質(zhì)細胞Caspase-3蛋白表達的影響。 結(jié)果(1)海人酸誘導(dǎo)驚厥后海馬星形膠質(zhì)細胞凋亡顯著增加,其miR-34b-5p表達水平顯著上調(diào)而Bcl-2蛋白表達明顯受到抑制；凋亡相關(guān)基因Bax及Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白表達顯著升高,Bax/Bcl-2的比值顯著增加。(2)與空白對照及轉(zhuǎn)染了miR-34b-5p mNC的海馬星形膠質(zhì)細胞相比,轉(zhuǎn)染了miR-34b-5p mimics的海馬星形膠質(zhì)細胞中miR-34b-5p的表達顯著增加,海馬星形膠質(zhì)細胞凋亡率、Bax/Bcl-2的比值、Bax及Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白表達顯著增加,而Bcl-2蛋白的表達顯著降低；而轉(zhuǎn)染了miR-34b-5p inhibitors的海馬星形膠質(zhì)細胞中]miR-34b-5p的表達顯著降低,海馬星形膠質(zhì)細胞凋亡率、Bax/Bcl-2的比值、Bax及Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白表達顯著降低,Bcl-2蛋白的表達則顯著增加。(3)miR-34b-5p負性調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白的表達,但對Bcl-2mRNA的表達無影響。(4) miR-34b-5p inhibitors顯著降低Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白的表達,而Bcl-2siRNA和miR-34b-5p inhibitors共轉(zhuǎn)染后Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白的表達顯著高于miR-34b-5p inhibitors組,表明Bcl-2siRNA的轉(zhuǎn)染能阻斷miR-34b-5p inhibitors導(dǎo)致的Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白的降低。 結(jié)論(1)海人酸誘導(dǎo)海馬星形膠質(zhì)細胞凋亡過程中,miR-34b-5p表達顯著增加。(2)成功構(gòu)建了miR-34b-5p過表達和低表達細胞模型,過表達miR-34b-5p能夠促進驚厥后海馬星形膠質(zhì)細胞凋亡,抑制miR-34b-5p的表達可以阻礙驚厥后海馬星形膠質(zhì)細胞凋亡。(3)miR-34b-5p通過在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因Bcl-2表達,從而促進Caspase-3活化,激活Caspase信號途徑對驚厥后海馬星形膠質(zhì)細胞凋亡進行調(diào)控。
【學(xué)位單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：R720.597
【部分圖文】：

甲醛變性凝膠電泳見28S和18S條帶清晰，5S條帶隱約可見，無明顯降解條帶，說明抽提的RNA純度和濃度符合要求。（見圖1-1)2 I妄C S3 -e。 會■28S18S5S圖1-1大鼠海馬組織總RNA純度鑒定Figure 1-1 Total RNA purity identification in hippocampus of rats12

于2h組和Id組（P<().05或PcO.Ol)，但仍然顯著高于對照組；第3d、7d時表達量逐漸下調(diào)，與對照組比較，無顯著性差異（P〉0.05)。（見圖2-1)★*8-1 **I 一 ■illiL> f 々c/圖2-1反復(fù)驚厥后大鼠海馬miR-34b-5p的表達Figure 2-1 miR-34b-5p expression in hippocampus of rats after recurrent seizures注：柱形圖代表均數(shù)士標(biāo)準差(n=8)，與對照組比較**P<0.01; 6h組與2h組比較*尸<0.05，和Id組比較*=^P<0.01。2驚厥后大鼠海馬Bd-2、Bax蛋白的表達Western Blot結(jié)果顯示，反復(fù)驚厥后2h大蘭l海馬Bcl-2蛋白水平與對照組相比無顯著變化（P>0.05), 6h較對照組顯著降低，Id時進一步下調(diào)，7d時下降最顯著（PO.Ol)(見圖2-2A, 2-2B)；而反復(fù)驚厥后Bax蛋白的表達呈現(xiàn)相反的趨勢，反復(fù)驚厥后2h大鼠海馬Bax蛋白水平較對照組顯著升高，6h表達量更高

Id時升高最明顯，3d、7d時仍顯著高于對照組（PO.Ol )。（見圖2-2A，2-2C)；Bax/Bcl-2的比值在反復(fù)驚厥后2h?7d均顯著高于對照組（PO.Ol)。（見圖2-3)29
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Sara De Iudicibus;Marianna Lucafò;Stefano Martelossi;Chiara Pierobon;Alessandro Ventura;Giuliana Decorti;;MicroRNAs as tools to predict glucocorticoid response in inflammatory bowel diseases[J];World Journal of Gastroenterology;2013年44期

本文編號：2870317