發(fā)布時(shí)間：2020-11-04 16:15

　　 第一部分發(fā)育期驚厥性腦損傷后海馬miRNA差異表達(dá)譜分析 目的篩選發(fā)育期驚厥性腦損傷后海馬差異表達(dá)的miRNAs,為進(jìn)一步探討miRNA在發(fā)育期驚厥性腦損傷發(fā)生機(jī)制中的作用提供依據(jù)。 方法健康清潔20日齡SD大鼠16只,隨機(jī)分為正常對(duì)照組和驚厥組,每組8只大鼠。三氟乙醚反復(fù)吸入(每天一次,連續(xù)6天)制作發(fā)育期驚厥模型,對(duì)照組除不吸入三氟乙醚外,其他處理同驚厥組。反復(fù)驚厥后1d大鼠斷頭取腦,分離海馬組織,提取總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,TaqMan(?) MicroRNA Array方法篩選出驚厥組與對(duì)照組大鼠海馬差異表達(dá)的miRNAs,并利用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)部分差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行二次驗(yàn)證。 結(jié)果TaqMan(?) MicroRNA Array檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有30個(gè)miRNAs在驚厥組和對(duì)照組海馬組織中表達(dá)差異顯著,差異倍數(shù)大于2倍以上。其中9個(gè)miRNAs上調(diào),21個(gè)miRNAs下調(diào)。上調(diào)顯著的miRNAs有：miR-34b-5p、miR-204等；下調(diào)顯著的有miR-582-3p,miR-672等。實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)差異表達(dá)的miR-34b-5p、miR-204、miR-582-3p、miR-672進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果與TaqMan低密度芯片結(jié)果趨勢(shì)一致,表明芯片結(jié)果可靠,提示miR-34b-5p、miR-204等miRNAs參與了發(fā)育期驚厥性腦損傷的發(fā)生過程。 結(jié)論MiR-34b-5p、miR-204等部分miRNAs在發(fā)育期驚厥組和正常對(duì)照海馬組織中存在顯著差異表達(dá),提示它們可能參與了發(fā)育期驚厥性腦損傷發(fā)生的分子機(jī)制。 第二部分MicroRNA-34b-5p及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bag、 Caspase-3在驚厥后海馬的動(dòng)態(tài)表達(dá)及意義 目的研究發(fā)育期大鼠反復(fù)驚厥后海馬組織miR-34b-5p及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化,探討miR-34b-5p在發(fā)育期驚厥性腦損傷后海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用。 方法96只20日齡健康Sprague-Dawley (SD)大鼠隨機(jī)分為2組：正常對(duì)照組和驚厥組。通過三氟乙醚反復(fù)吸入(連續(xù)6次,每天1次)制作發(fā)育期大鼠驚厥動(dòng)物模型。用qRT-PCR方法檢測(cè)反復(fù)驚厥后2h、6h、Id、3d、7d海馬組織中miR-34b-5p的表達(dá)；Western Blot方法檢測(cè)海馬組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)。 結(jié)果(1)實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,反復(fù)驚厥后2h-1d海馬miR-34b-5p的表達(dá)均較對(duì)照組顯著增高(P0.01),3d、7d時(shí)逐漸恢復(fù)至正常水平(P0.05)。(2) Western blot結(jié)果顯示,反復(fù)驚厥后2h大鼠海馬Bcl-2蛋白水平與對(duì)照組相比無顯著變化(P0.05),6h較對(duì)照組顯著降低,1d時(shí)進(jìn)一步下調(diào),7d時(shí)下降最顯著(P0.01)；而反復(fù)驚厥后Bax、Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)相反的趨勢(shì),反復(fù)驚厥后2h大鼠海馬Bax、Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白水平較對(duì)照組顯著升高,6h表達(dá)量更高,1d時(shí)升高最明顯,3d、7d時(shí)仍顯著高于對(duì)照組(P0.01); Bax/Bcl-2的比值在反復(fù)驚厥后各時(shí)間點(diǎn)皆顯著高于對(duì)照組(P0.01)。 結(jié)論反復(fù)驚厥后早期海馬miR-34b-5p的表達(dá)顯著增強(qiáng),同時(shí)伴有促凋亡相關(guān)基因Bax, Caspase-3活性蛋白的表達(dá)增強(qiáng),Bax/Bcl-2的比值升高,而抗凋亡基因Bcl-2蛋白的表達(dá)降低,提示miR-34b-5p可能在發(fā)育期驚厥性腦損傷后早期神經(jīng)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。 第三部分MicroRNA-34b-5p的靶基因預(yù)測(cè)及驗(yàn)證 目的預(yù)測(cè)并驗(yàn)證miR-34b-5p作用的靶基因,進(jìn)一步了解miR-34b-5p的生物學(xué)功能及在發(fā)育期驚厥性腦損傷中的作用機(jī)制。 方法利用靶基因預(yù)測(cè)軟件分析得到miR-34b-5p作用的靶基因。構(gòu)建野生型靶基因3'-UTR和變型靶基因3'-UTR熒光素酶報(bào)告基因載體,將這兩個(gè)載體分別與miR-34b-5p mimics或miR-34b-5p陰性載體(miR-34b-5p m NC)共同轉(zhuǎn)染海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞,雙熒光素酶報(bào)告基因分析檢測(cè)熒光素酶活性變化以證實(shí)該靶基因是否為miR-34b-5p作用的靶基因。 結(jié)果(1)軟件預(yù)測(cè)Bcl-2基因?yàn)閙iR-34b-5p作用的靶基因。(2)與轉(zhuǎn)染miR-34b-5p m NC相比,共轉(zhuǎn)染miR-34b-5p mimics和野生型Bcl-23'-UTR的熒光素酶活性顯著下降,而轉(zhuǎn)染突變型Bcl-23'-UTR的熒光素酶活性則無明顯變化,證實(shí)Bcl-2基因是miR-34b-5p直接作用的靶基因。 結(jié)論成功構(gòu)建了野生型和突變型Bcl-23'-UTR熒光素酶報(bào)告基因載體；軟件預(yù)測(cè)并經(jīng)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)Bcl-2基因是miR-34b-5p直接作用的靶基因。 第四部分MicroRNA-34b-5p對(duì)驚厥后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制 目的研究miR-34b-5p對(duì)驚厥后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響,闡明miR-34b-5p調(diào)控驚厥后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。 方法(1)原代分離培養(yǎng)大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞,以海人酸干預(yù)誘導(dǎo)細(xì)胞驚厥。應(yīng)用TUNEL染色檢測(cè)不同濃度海人酸對(duì)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響,確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)海人酸處理用濃度。并以實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)海人酸干預(yù)后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞miR-34b-5p表達(dá)水平的改變,Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平的改變。(2)利用脂質(zhì)體將miR-34b-5p模擬物(miR-34b-5p mimics)、miR-34b-5p抑制劑(miR-34b-5p inhibitors)以及相對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照(miR-34b-5p m NC、miR-34b-5p i NC)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后miR-34b-5p的表達(dá)。并檢測(cè)海人酸誘導(dǎo)驚厥后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)指標(biāo)的變化。Bcl-2mRNA的表達(dá)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)：海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡用TUNEL染色進(jìn)行檢測(cè)；凋亡相關(guān)指標(biāo)Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)用Western Blot檢測(cè)。(3)分別將control siRNA、Bcl-2siRNA、miR-34b-5p inhibitors以及Bcl-2siRNA+miR-34b-5p inhibitors轉(zhuǎn)染海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞,并用海人酸進(jìn)行干預(yù),Western Blot檢測(cè)Bcl-2沉默后對(duì)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果(1)海人酸誘導(dǎo)驚厥后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡顯著增加,其miR-34b-5p表達(dá)水平顯著上調(diào)而Bcl-2蛋白表達(dá)明顯受到抑制；凋亡相關(guān)基因Bax及Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白表達(dá)顯著升高,Bax/Bcl-2的比值顯著增加。(2)與空白對(duì)照及轉(zhuǎn)染了miR-34b-5p mNC的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染了miR-34b-5p mimics的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞中miR-34b-5p的表達(dá)顯著增加,海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率、Bax/Bcl-2的比值、Bax及Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白表達(dá)顯著增加,而Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著降低；而轉(zhuǎn)染了miR-34b-5p inhibitors的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞中]miR-34b-5p的表達(dá)顯著降低,海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率、Bax/Bcl-2的比值、Bax及Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白表達(dá)顯著降低,Bcl-2蛋白的表達(dá)則顯著增加。(3)miR-34b-5p負(fù)性調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白的表達(dá),但對(duì)Bcl-2mRNA的表達(dá)無影響。(4) miR-34b-5p inhibitors顯著降低Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白的表達(dá),而Bcl-2siRNA和miR-34b-5p inhibitors共轉(zhuǎn)染后Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白的表達(dá)顯著高于miR-34b-5p inhibitors組,表明Bcl-2siRNA的轉(zhuǎn)染能阻斷miR-34b-5p inhibitors導(dǎo)致的Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白的降低。 結(jié)論(1)海人酸誘導(dǎo)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡過程中,miR-34b-5p表達(dá)顯著增加。(2)成功構(gòu)建了miR-34b-5p過表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞模型,過表達(dá)miR-34b-5p能夠促進(jìn)驚厥后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡,抑制miR-34b-5p的表達(dá)可以阻礙驚厥后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡。(3)miR-34b-5p通過在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因Bcl-2表達(dá),從而促進(jìn)Caspase-3活化,激活Caspase信號(hào)途徑對(duì)驚厥后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)控。
【學(xué)位單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：R720.597
【部分圖文】：

甲醛變性凝膠電泳見28S和18S條帶清晰，5S條帶隱約可見，無明顯降解條帶，說明抽提的RNA純度和濃度符合要求。（見圖1-1)2 I妄C S3 -e。 會(huì)■28S18S5S圖1-1大鼠海馬組織總RNA純度鑒定Figure 1-1 Total RNA purity identification in hippocampus of rats12

于2h組和Id組（P<().05或PcO.Ol)，但仍然顯著高于對(duì)照組；第3d、7d時(shí)表達(dá)量逐漸下調(diào)，與對(duì)照組比較，無顯著性差異（P〉0.05)。（見圖2-1)★*8-1 **I 一 ■illiL> f 々c/圖2-1反復(fù)驚厥后大鼠海馬miR-34b-5p的表達(dá)Figure 2-1 miR-34b-5p expression in hippocampus of rats after recurrent seizures注：柱形圖代表均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(n=8)，與對(duì)照組比較**P<0.01; 6h組與2h組比較*尸<0.05，和Id組比較*=^P<0.01。2驚厥后大鼠海馬Bd-2、Bax蛋白的表達(dá)Western Blot結(jié)果顯示，反復(fù)驚厥后2h大蘭l海馬Bcl-2蛋白水平與對(duì)照組相比無顯著變化（P>0.05), 6h較對(duì)照組顯著降低，Id時(shí)進(jìn)一步下調(diào)，7d時(shí)下降最顯著（PO.Ol)(見圖2-2A, 2-2B)；而反復(fù)驚厥后Bax蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，反復(fù)驚厥后2h大鼠海馬Bax蛋白水平較對(duì)照組顯著升高，6h表達(dá)量更高

Id時(shí)升高最明顯，3d、7d時(shí)仍顯著高于對(duì)照組（PO.Ol )。（見圖2-2A，2-2C)；Bax/Bcl-2的比值在反復(fù)驚厥后2h?7d均顯著高于對(duì)照組（PO.Ol)。（見圖2-3)29
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Sara De Iudicibus;Marianna Lucafò;Stefano Martelossi;Chiara Pierobon;Alessandro Ventura;Giuliana Decorti;;MicroRNAs as tools to predict glucocorticoid response in inflammatory bowel diseases[J];World Journal of Gastroenterology;2013年44期

本文編號(hào)：2870317