川崎病(Kawasaki Disease,KD)是一種兒童期較常見的發(fā)熱、出疹性疾病,主要病理特征是全身中小血管炎癥。近年來,該病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢,成為目前兒童后天性心臟病的首位病因。盡管川崎病日益受到重視,但川崎病的的病因和發(fā)病機制尚未闡明。深入探討川崎病狀態(tài)下的器官損傷機制,尋找針對性的治療策略仍是亟待解決的重要問題。我們在臨床觀察中逐步注意到,除了急性發(fā)熱、出疹等主要診斷標準中的臨床表現(xiàn)之外,川崎病導致的重要器官損傷和功能減退不容忽視。心、肺功能對生命體至關重要,川崎病狀態(tài)下可累及心臟功能和肺血管功能損傷,但川崎病致心肌損傷和肺血管重構的生物學機制并不十分清楚。以往研究顯示,異常的炎癥反應在川崎病發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。因此,川崎病狀態(tài)下炎癥因子的作用和機制理應成為關注的重點。脂質(zhì)運載蛋白-2(lipocalin-2,Lcn 2)是一種由脂肪組織、中性粒細胞、巨噬細胞等分泌的細胞因子,它可以作為炎癥介導的啟動因子。新近發(fā)現(xiàn),在一些惡性疾病中Lcn 2水平變化對細胞生存有重要影響,與心、肺器官損傷程度具有相關性。更為重要的是,針對不同類型的細胞,Lcn 2具有促進或者抑制細胞凋亡的不同生物學效應。目前,關于Lcn 2在川崎病相關心肌損傷和肺血管重構中的作用和機制尚屬未知。為深入探討川崎病相關心肌損傷和肺血管重構的生物學機制,本研究采用川崎病大鼠模型,從體內(nèi)和體外實驗分析Lcn 2是否參與川崎病狀態(tài)下心、肺損傷的病理生理過程并闡明潛在的信號機制。本課題進行了兩部分的研究工作。第一部分川崎病誘發(fā)肺血管重構的實驗研究近年來有臨床病例報道,部分川崎病患者合并肺動脈高壓,出現(xiàn)肺動脈擴張、右心室壓力升高等臨床表現(xiàn)。而且,部分因冠狀動脈瘤猝死的川崎病患者尸檢時發(fā)現(xiàn)肺血管被廣泛累及,肺動脈也存在狹窄、肥厚等病理性的結構改變,提示川崎病能夠累及到肺動脈,引起肺動脈結構和功能的改變。目的:探討Lcn 2在川崎病誘發(fā)肺血管重構過程中的作用和潛在機制。方法:采用干酪乳桿菌細胞壁提取物(LCWE)腹腔內(nèi)注射建立川崎病大鼠模型;組織形態(tài)學檢測肺動脈結構的病理改變;ELISA法檢測循環(huán)水平和肺組織勻漿中Lcn 2的含量;血流動力學檢測平均左頸總動脈壓(m CAP)及右心室收縮壓(RVSP)。體外實驗采用原代培養(yǎng)大鼠肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)和中性粒細胞(PMNs),ELISA法檢測Lcn 2的含量,并進一步采用Western blotting和RT-PCR檢測分析相關蛋白和m RNA水平。結果:1.川崎病大鼠出現(xiàn)右心室壓升高和肺小動脈重構。1月齡SD大鼠(體重80~100g)腹腔注射LCWE 0.5ml(1mg/ml)14天后,肺組織出現(xiàn)水腫和局部點、片狀出血,大量中性粒細胞為主伴有少量淋巴細胞和單核細胞浸潤。雖然各組大鼠的m CAP無明顯改變,但是RVSP升高,右心肥厚指數(shù)[RV/(LV+S)]%顯著增加。至28天后,發(fā)現(xiàn)局灶性肺不張和肺氣腫,肺小動脈內(nèi)皮細胞腫脹。鏡下觀察肺小動脈中膜增厚,管腔狹窄。組織學提示肺動脈平滑肌層增厚。結果提示,川崎病動物出現(xiàn)肺循環(huán)阻力的升高、右心結構改變,同時伴有肺動脈炎癥細胞浸潤、平滑肌層增厚、血管管腔狹窄等肺動脈重構的表現(xiàn)。2.川崎病大鼠肺動脈組織出現(xiàn)促增生性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ER stress)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與肺動脈高壓和平滑肌層增厚關系密切。我們的實驗發(fā)現(xiàn):川崎病狀態(tài)下肺動脈組織中,ER stress相關促增生蛋白ATF6裂解(60 k D)較對照組升高,顯著增加ATF6核轉(zhuǎn)位,進而升高GRP78和NOGO的m RNA和蛋白水平。另一方面,ER stress相關促凋亡蛋白CHOP表達以及核轉(zhuǎn)位未發(fā)生明顯變化,促凋亡蛋白Caspase 12的表達未見升高。3.川崎病大鼠血漿和肺組織中Lcn 2水平顯著升高。與對照組相比,LCWE注射后14天,川崎病大鼠血漿和肺組織勻漿中Lcn 2含量達高峰,并維持較高水平。通過體外實驗對比發(fā)現(xiàn),LCWE刺激后增多的Lcn 2可能來源于循環(huán)中或者肺組織中的PMNs。4.Lcn 2促肺動脈平滑肌細胞增生。上述結果明確:川崎病的肺動脈組織增生性反應同時伴有Lcn 2升高。我們進一步觀察Lcn 2是否導致肺動脈平滑肌細胞增生。細胞學實驗發(fā)現(xiàn),Lcn 2處理PASMCs可直接導致ATF6裂解和核轉(zhuǎn)位,GRP78和NOGO表達顯著增高;反之,促凋亡的CHOP和Caspase 12水平未見升高。檢測細胞增殖率發(fā)現(xiàn)Lcn 2處理顯著促進PASMCs增殖。上述結果表明,Lcn 2在肺動脈平滑肌細胞增生性轉(zhuǎn)變中發(fā)揮重要作用。5.抑制增生性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激改善川崎病大鼠肺血管重構。為了尋找針對性的防治措施,我們對川崎病大鼠采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的特異性抑制劑PBA治療。細胞學實驗發(fā)現(xiàn)1m M PBA處理能夠顯著抑制Lcn 2引起的PASMCs增殖。整體動物實驗證實1月齡大鼠在注射LCWE后給予PBA(500 mg/kg)治療14天,可有效降低RVSP和右心肥厚,有效抑制肺小血管的結構改變。結論:本研究證實:川崎病狀態(tài)下可誘發(fā)肺血管重構和肺動脈平滑肌細胞增殖同時伴有Lcn 2顯著升高。Lcn 2誘導的促增生性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在肺動脈平滑肌細胞增生性轉(zhuǎn)變中發(fā)揮重要作用。針對性的抑制ER stress是防治川崎病相關肺血管損傷的有效措施。第二部分川崎病致心肌損傷的實驗研究除了血管炎性損傷外,川崎病是否存在直接的心肌損傷,目前仍缺乏系統(tǒng)的實驗研究。有研究顯示Lcn 2作為重要的炎癥分子,與心肌細胞和血管內(nèi)皮細胞損傷、細胞凋亡等密切相關,參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。我們在第一部分的研究中發(fā)現(xiàn)川崎病狀態(tài)下血漿中Lcn 2水平顯著升高,由此促使我們進一步探討川崎病誘發(fā)心肌損傷,并分析Lcn 2在此過程中的作用。目的:探討Lcn 2在川崎病誘發(fā)損傷中的作用和潛在機制。方法:建立川崎病大鼠模型(方法同第一部分);ELISA法檢測川崎病大鼠血漿、心肌組織勻漿中以及臨床川崎病患者血漿中Lcn 2的含量;心臟超聲檢測大鼠心臟收縮舒張功能;Masson染色,評估心肌纖維化的程度;熒光實時定量PCR法檢測心肌組織中IL-6、CD3、CD45和Collagen I的m RNA表達;Western blotting方法檢測心肌組織中Caspase 3、CHOP、ATF6、p-PERK、p-el F2α和Caspase 12等蛋白的表達。結果:1.川崎病誘發(fā)心臟收縮舒張功能障礙和炎癥反應。采用心臟超聲檢查證實:與對照組相比,川崎病大鼠心臟左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)增加,左室射血分數(shù)(LVEF)降低(P0.05)。該結果提示,川崎病狀態(tài)下心臟發(fā)生擴張并出現(xiàn)泵血能力下降。Masson染色顯示川崎病大鼠心肌出現(xiàn)一定程度心肌纖維化和膠原沉積。心肌中的IL-6、CD3和CD45等炎癥相關分子的m RNA表達水平顯著升高(P0.05)。2.川崎病狀態(tài)下心臟組織和循環(huán)水平Lcn 2升高。我們進一步發(fā)現(xiàn),川崎病狀態(tài)下大鼠血漿中Lcn 2的含量逐步升高,于建模7天出現(xiàn)統(tǒng)計學差異。至14天達到峰值,并維持較高水平于28天以上。建模28天后,取心肌組織勻漿檢測同樣證實川崎病大鼠心肌組織中Lcn 2水平較對照組顯著升高(P0.05)。更為重要的是,臨床血漿樣本也證實,川崎病患者循環(huán)水平的Lcn 2較正常對照組出現(xiàn)升高(n=6,P0.05)。3.Lcn 2促膠原形成。為明確Lcn 2是否參與了心肌膠原纖維沉積。我們采用培養(yǎng)的心肌成纖維細胞,給予Lcn 2(10 ng/ml)處理48小時。結果發(fā)現(xiàn)Collagen I的m RNA和蛋白表達水平均升高(P0.05)。并且發(fā)現(xiàn),Lcn 2處理可顯著上調(diào)心肌成纖維細胞NF-кB和IкB的磷酸化水平。采用IкB的抑制劑BAY 11-7082(2.5μmol/L)處理可有效抑制Lcn 2對Collagen I蛋白的上調(diào)作用。上述結果表明:Lcn 2可能通過激活NF-кB信號促膠原的形成。4.Lcn 2誘導心肌細胞促凋亡性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ER stress)。除了成纖維細胞,我們進一步探討Lcn 2對心肌細胞的直接作用。我們采用原代培養(yǎng)的心肌細胞,給予Lcn2(10 ng/ml)處理48小時。結果發(fā)現(xiàn):Lcn 2誘導心肌細胞出現(xiàn)凋亡。ER stress的標志物ATF6、CHOP、p-PERK、p-el F2α均出現(xiàn)升高,導致凋亡信號Caspase 12和cleave-Caspase 3水平顯著增高。定量檢測心肌細胞Caspase 3活性顯著增高(P0.05)。上述結果表明,與成纖維細胞所不同的是,Lcn 2對心肌細胞的直接作用為誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激導致心肌凋亡。5.抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激緩解川崎病大鼠心肌細胞凋亡改善心臟功能。在明確了Lcn 2誘導心肌細胞促凋亡性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的作用基礎上,我們采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑4-苯基丁酸(4-PBA)處理(500mg/kg,灌胃,每天一次,持續(xù)14天)。結果發(fā)現(xiàn):PBA處理有效抑制川崎病狀態(tài)下的心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激程度,降低ATF6、CHOP、p-PERK、p-el F2α水平,降低Caspase 12和cleave-Caspase 3水平(P0.05)。TUNEL結果證實,抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可有效降低川崎病大鼠心肌細胞凋亡,并最終改善川崎病大鼠舒張功能。結論:本研究證實:川崎病狀態(tài)下可誘發(fā)心肌成纖維細胞膠原合成增加和炎癥反應,同時伴有Lcn 2顯著升高。我們發(fā)現(xiàn)Lcn 2對心肌細胞的直接作用是促凋亡性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。抑制川崎病狀態(tài)下的心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可抑制心肌凋亡改善心臟功能�？偨Y:本系列研究明確發(fā)現(xiàn)Lcn 2在川崎病相關心功能損傷和肺血管損傷過程中起重要作用。針對不同類型的細胞(可增殖的肺動脈平滑肌細胞,不增殖的心肌細胞),Lcn 2具有促增生或者促凋亡的不同生物學效應;Lcn 2觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是上述生物學現(xiàn)象的主要細胞機制。上述機制共同導致了心肌損傷和肺動脈重構在川崎病狀態(tài)下共存。由于目前,尚沒有成熟可行的Lcn 2干預手段(例如中和抗體),抑制川崎病狀態(tài)下的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可能是防治川崎病相關心肌損傷和肺動脈重構的可行途徑。
【學位單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R725.4
【部分圖文】：
同時反映右心肥厚的指標[RV/ (LV+S)]%也有明顯的增加（圖 1.1 C，P < 0.05）。HE 染色后觀察（圖1.1 D），對照組大鼠（Con 組）的肺組織結構基本正常，肺小動脈管腔大小正常，內(nèi)膜平整，肌層無增厚。而 LCWE 7 d 組可見肺組織炎細胞浸潤，滲出，肺小動脈壁厚度輕度增加，平滑肌層出現(xiàn)不規(guī)則階段性肥厚。LCWE 14 d 組的肺小動脈壁層和平滑肌層出現(xiàn)更明顯的增厚。LCWE 21 d 組可見肺組織出現(xiàn)水腫和局部點、片狀出血，大量中性粒細胞為主伴有少量淋巴細胞和單核細胞浸潤。肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔縮小，發(fā)現(xiàn)局灶性肺不張和肺氣腫，肺小動脈內(nèi)皮細胞出現(xiàn)腫脹，肺小動脈中膜厚度增加，平滑肌層出現(xiàn)不規(guī)則間斷性肥厚，管腔明顯狹窄。LCWE 28 d 組的肺小動脈管腔幾乎閉塞。代表肺小動脈增厚的指標 WA %和 WT %均顯著增加（圖1.1 E 和 F，P < 0.05）。我們又進行了肺小動脈的 PCNA 染色，以評估肺小動脈增殖的情況。結果顯示，LCWE 注射 28 天，大鼠表現(xiàn)為肺小動脈平滑肌明顯增厚，管腔明顯狹窄，鏡下增殖的平滑肌細胞核呈棕黃色，PCNA 表達較對照組明顯增加（圖 1.1 G 和 H
-60圖 1.2 川崎病大鼠肺小動脈促增生性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激分離川崎病大鼠 1~3 級肺小動脈，提取肺小動脈蛋白和 mRNA，檢測相關內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志物的表達情況。（A） 肺小動脈相關內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志物表達；（B）細胞核內(nèi) ATF6 和 CHOP 的表達變化；（C）肺小動脈組織中 GRP78 和 NOGO 的 mRNA表達變化。與對照組相比較，* P < 0.05, n=8。Figure.1. 2. Kawasaki disease rat pulmonary arteries promote proliferativeendoplasmic reticulum stressIsolation of 1 to 3 pulmonary arterioles from Kawasaki disease rats to extract pulmonaryarterial proteins and mRNA, and to detect the expression of related endoplasmicreticulum stress markers. (A) Pulmonary arteriolar-associated endoplasmic reticulum
Lcn 2 水平達高峰，并且持續(xù)保持高水平至 28 天以上（圖1.3A 和 B，P < 0.05）。肺組織中 Lcn 2 蛋白表達水平也呈同樣的趨勢變化（圖 1.3C，與對照組相比，P < 0.05），表明川崎病大鼠血漿中和肺組織勻漿中可溶性 Lcn 2 的含量顯著性增加，肺組織中 Lcn 2 的蛋白表達也一直在保持較高的水平。3.4 川崎病狀態(tài)下 Lcn 2 的來源分析在明確了川崎病狀態(tài)下 Lcn 2 出現(xiàn)升高之后，我們初步分析 Lcn 2 可能的細胞來源，采用 LCWE 分別處理 PASMCs 細胞和 PMNs 細胞，進行差異分析。原代培養(yǎng)的 PASMCs 加入不同濃度的 LCWE（0.1~20 μg/ml）后檢測細胞上清液中 Lcn 2 的含量
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本文編號：
2865691
