發(fā)布時間：2020-10-26 18:51

　　 目的支氣管哮喘(哮喘)是一種發(fā)病機制復雜的常見慢性呼吸道疾病,其發(fā)病率呈不斷上升趨勢,但其確切機制至今尚未完全清楚。微小RNA(microRNA,簡稱miRNA或miR)是一類長度約為22nt(核苷酸)的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA。研究發(fā)現(xiàn),miRNA可以控制人類基因組中所有基因中的30%,并在各種生物過程中具有重要功能,包括細胞增殖分化及凋亡,機體代謝,組織損傷修復,生物發(fā)育等,從而參與哮喘等疾病的發(fā)生與發(fā)展,但miRNA中參與哮喘的具體種類及具體的信號機制尚不清楚。因此本實驗主要研究哮喘兒童支氣管肺泡灌洗液(BALF)中miRNA的表達水平并探討可能的作用機制。方法2016年01月至2017年02月期間,收集確診為哮喘患兒15例做為實驗組,同時收集12例異物患兒(異物在24小時內(nèi)移除)作為對照組。應用miRNA芯片檢測miRNA的表達水平,并通過qRT-PCR驗證其表達水平。并分別采用qPCR和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)方法,對于兩組間表達差異較顯著的miRNA家族(miR-34家族和miR-200家族)的預測靶基因E-鈣粘蛋白(E-cadherin)的mRNA和蛋白質(zhì)水平進行檢測。結(jié)果1.在正常對照組患兒的支氣管肺泡灌洗液中,發(fā)現(xiàn)存在超過800種miRNAs的表達,其中最豐富的 10 種 miRNAs 是 let-7b-5p、miR-191-5p、miR-23a-3p、miR-4454、miR-24-3p、miR-7704、let-7c-5p、let-miR-103a-3p 和 miR-3960。2.miRNA芯片檢測發(fā)現(xiàn),哮喘組患兒的支氣管肺泡灌洗液中存在65種miRNAs與對照組有差異表達,包括43個下調(diào)的miRNAs和22個上調(diào)的miRNAs。下調(diào)的miRNAs中包含miR-34/449家族中的6種miRNAs和miR-200家族中的7種miRNAs,占所有下調(diào)miRNAs的30.2%。3.對miR-34/449家族和miR-200家族中的13種miRNA定量RT-PCR驗證發(fā)現(xiàn),miR-34/449家族中的4種和miR-200家族中的6種表達水平與miRNA芯片結(jié)果一致,包括 miR-34b-3p、miR-34b-5p、miR-34c-3p、miR-34c-5p、miR-200a-3p、miR-200a-5p、miR-200b-3p、miR-200b-5p、miR-200c-3p 和 miR-141-3p。4.miR-34家族和miR-200家族的預測靶基因中E-cadherin基因,在兩組間存在差異性表達,且其在哮喘兒童的支氣管肺泡灌洗液中表達下調(diào)(P0.05)。結(jié)論miRNAs特別是miR-34和miR-200家族,參與了哮喘的發(fā)生,并可能通過調(diào)控靶基因E-cadherin的表達參與兒童哮喘的發(fā)病,這為哮喘的治療提供了可能的治療靶點或者新方向。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R725.6
【文章目錄】：
致謝
中文摘要
英文摘要
中英文縮略詞
1 前言
2 實驗材料
    2.1 主要實驗儀器
    2.2 主要實驗試劑與材料
    2.3 PCR所需引物
3 實驗方法
    3.1 研究對象
    3.2 納入標準和剔除標準
    3.3 支氣管肺泡灌洗液（BALF）的收集
    3.4 RNA抽提（TRIzol法）
    3.5 miRNA芯片
    3.6 PCR技術(shù)
    3.7 PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳
    3.8 蛋白濃度的測定
    3.9 統(tǒng)計學分析
4 實驗結(jié)果
    4.1 對照組miRNA結(jié)果
    4.2 差異表達的miRNA
    4.3 差異表達miRNA的驗證
    4.4 差異表達miRNA家族（2個家族）靶基因及信號通路的預測
    4.5 靶基因E-cadherin及其蛋白表達水平的測定
5 討論
6 結(jié)論
7 不足與進一步展望
參考文獻
綜述
    參考文獻
作者簡歷

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本文編號：2857384