目的 建立人類偏肺病毒(Human Metapneumovirus HMPV)和人類人類冠狀病毒OC43(Human Coronavirus OC43,HCoV-OC43)實(shí)時熒光定量PCR (real-time Fluorescent Quantitative FQ- PCR)檢測方法,并探討二者在福州地區(qū)急性呼吸道感染(Acute Respiratory Tract Infection ARTI)患兒中感染情況及臨床意義。 方法 收集2007年10月～2008年4月福建省立醫(yī)院ARTI患兒的咽拭子標(biāo)本,共176例。標(biāo)本中急性上呼吸道感染( Acute Upper Respiratory Tract Infection AURTI)118例,支氣管炎31例,肺炎21例,哮喘6例。利用建立的FQ- PCR方法檢測HMPV和HCoV-OC43的N基因部分片段,并對部分陽性產(chǎn)物進(jìn)行測序鑒定。 結(jié)果 1、建立的FQ-PCR法檢測HMPV的靈敏度為102copies/μl,批內(nèi)變異系數(shù)(CV)為0.18%,批間CV為1.98%,對RSV、HBoV、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-HKU1等呼吸道病毒未出現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)。 2、176例標(biāo)本中,共檢出HMPV陽性29例(16.5 %);隨機(jī)選取HMPV陽性擴(kuò)增產(chǎn)物2份進(jìn)行序列測定,結(jié)果分析顯示核苷酸序列完全一致,與GenBank中HMPV部分代表株序列一致性達(dá)100%。 3、AURTI組HMPV陽性率為15.3%(18/118),支氣管炎組陽性率19.4%(6/31),肺炎組陽性率19.0%(4/21),哮喘組陽性率16.7%(1/6)�！�2歲者占陽性患兒的75.8%(22/29)。感染月份在11月～3月,高峰期在1月。 4、建立的FQ-PCR法檢測HCoV-OC43的靈敏度為102copies/μl,批內(nèi)變異系數(shù)(CV)為0.53%,批間CV為1.46%,對RSV、HBoV、HMPV、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-HKU1等呼吸道病毒未出現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)。 5、176例標(biāo)本中,共檢出HCoV-OC43陽性8例(4.5%);隨機(jī)選取HCoV-OC43陽性擴(kuò)增產(chǎn)物2份進(jìn)行序列測定,結(jié)果分析顯示核苷酸序列完全一致,與GenBank中HCoV-OC43部分代表株序列一致性達(dá)100%。 6、AURTI組HCoV-OC43陽性率為5.9%(7/118),肺炎組陽性率4.8%(1/21)�！�1歲者占陽性患兒的75%(6/8)。感染月份分布在10月～1月,高峰期在12月。 結(jié)論 1、HMPV和HCoV-OC43均是福州地區(qū)2007～2008年冬春季急性呼吸道感染患兒的重要病毒病原。 2、HMPV除表現(xiàn)AURTI外,還可表現(xiàn)為支氣管炎、肺炎、哮喘,感染年齡以≤2歲為主。HCoV-OC43感染多表現(xiàn)為AURTI,年齡以≤1歲為主。 3、建立的檢測HMPV和HCoV-OC43的FQ-PCR法有良好的靈敏度、重復(fù)性與特異性。 4、建議開展對ARTI兒童HMPV和HCoV-OC43臨床常規(guī)檢測。
【學(xué)位單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R725.6;R450
【部分圖文】：

14圖 2 重組質(zhì)粒 HMPV-N 基因酶切圖A ladder)； 2 重組質(zhì)粒約 48 處出現(xiàn)的條帶，即插入的 HMPV質(zhì)粒測序性的引物擴(kuò)增重組質(zhì)粒，擴(kuò)增T 比較，結(jié)果證實(shí)所擴(kuò)增的片段

圖 3 重組質(zhì)粒 HMPV-N 基因的部分序列圖（三）重組質(zhì)粒的定量重組質(zhì)粒的濃度（拷貝/μl）計算。將提取的重組質(zhì)粒 DNA，用 GeneQuant Pro 儀測其 OD 值，儀器直接計算出其濃度。重組質(zhì)粒 HMPV-N 基因的濃度為 105.7μg/μl，通過下述公式將重組質(zhì)粒濃度單位由μg/μl 轉(zhuǎn)換成 copies/μl質(zhì)粒 DNA 濃度＝ 質(zhì)粒 DNA 濃度（μg/μl）× 6.2×1023(copies/μl) 660g/mol×堿基對數(shù)經(jīng)換算后得出重組質(zhì)粒 HMPV-N 基因為 2.1x1010copies/μl三、標(biāo)準(zhǔn)曲線重組質(zhì)粒HMPV-N基因標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線 以倍比稀釋的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（104-107）copies/μl為模板，在ABI7300擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=–3.69 X+35.05（其中Y對應(yīng)Ct值，X為標(biāo)本拷貝數(shù)，圖4）

圖 3 重組質(zhì)粒 HMPV-N 基因的部分序列圖（三）重組質(zhì)粒的定量重組質(zhì)粒的濃度（拷貝/μl）計算。將提取的重組質(zhì)粒 DNA，用 GeneQuant Pro 儀測其 OD 值，儀器直接計算出其濃度。重組質(zhì)粒 HMPV-N 基因的濃度為 105.7μg/μl，通過下述公式將重組質(zhì)粒濃度單位由μg/μl 轉(zhuǎn)換成 copies/μl質(zhì)粒 DNA 濃度＝ 質(zhì)粒 DNA 濃度（μg/μl）× 6.2×1023(copies/μl) 660g/mol×堿基對數(shù)經(jīng)換算后得出重組質(zhì)粒 HMPV-N 基因為 2.1x1010copies/μl三、標(biāo)準(zhǔn)曲線重組質(zhì)粒HMPV-N基因標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線 以倍比稀釋的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（104-107）copies/μl為模板，在ABI7300擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=–3.69 X+35.05（其中Y對應(yīng)Ct值，X為標(biāo)本拷貝數(shù)，圖4）
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2856500