類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要病理表現(xiàn)的慢性自身免疫性關(guān)節(jié)疾病。發(fā)病時,關(guān)節(jié)滑膜最先受累,其病理組織學(xué)的變化為在多種炎性因子的刺激下,關(guān)節(jié)滑膜類腫瘤樣無限增生、新血管形成、關(guān)節(jié)囊增厚,增生的滑膜表面形成血管翳,逐漸向關(guān)節(jié)面和關(guān)節(jié)軟骨擴(kuò)展、侵蝕,并最終破壞關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨,使關(guān)節(jié)畸形和失去功能。關(guān)節(jié)炎治療的首要目的是控制炎癥、阻止關(guān)節(jié)破壞。由于RA的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,目前還沒有令人滿意的療法。 木瓜苷(glucosides of Chaenomeles speciosa,GCS)是課題組從木瓜中提取分離得到的抗炎鎮(zhèn)痛有效部位,兒茶素[(+)-catechin,Cat)]是從木瓜中得到的單體。本課題組前期研究表明,GCS具有抗炎和鎮(zhèn)痛作用,可減輕佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis ,AA )大鼠和膠原性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠的繼發(fā)性足腫脹、關(guān)節(jié)疼痛、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎等表現(xiàn),還可恢復(fù)體重,改善關(guān)節(jié)病理形態(tài)學(xué)的異常。GCS對關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用與其介導(dǎo)大鼠滑膜細(xì)胞鳥苷酸結(jié)合蛋白(Guanine nucleotide- binding proteins,簡稱G蛋白)偶聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān),即GCS通過抑制關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞Gαi mRNA表達(dá),增強(qiáng)Gαs mRNA表達(dá),使第二信使環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophophate, cAMP)生成增加,從而調(diào)節(jié)過高的滑膜細(xì)胞的分泌功能和增殖能力。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)白芍總苷可通過抑制AA大鼠滑膜組織有絲分裂原蛋白激酶信號通路活化和通過改善滑膜細(xì)胞的功能延緩AA滑膜增生和軟骨破壞;白芍總苷還可調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)前列腺素受體的表達(dá)。本研究在復(fù)制大鼠AA病理模型的基礎(chǔ)上,探討Cat和GCS對大鼠AA的治療作用;并從對AA大鼠滑膜細(xì)胞G蛋白偶聯(lián)前列腺素受體表達(dá)和脫敏的影響來闡明GCS和Cat可能的作用機(jī)制。 目的: 根據(jù)大鼠AA的關(guān)節(jié)局部腫脹、疼痛、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎及病理形態(tài)學(xué)等改變,明確Cat對大鼠AA的治療作用及Cat是否是GCS發(fā)揮作用的主要有效成分之一;以AA發(fā)病的靶細(xì)胞—滑膜細(xì)胞為突破口,探討GCS和Cat抑制AA大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的增殖與cAMP水平之間的關(guān)系;選擇AA滑膜細(xì)胞的G蛋白偶聯(lián)前列腺素受體EP2的脫敏機(jī)制為切入點,分析GCS和Cat是否通過影響AA大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞G蛋白偶聯(lián)前列腺素受體EP2的脫敏而發(fā)揮效應(yīng)? 方法: 大鼠足跖皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑(Freund’s completed Adjuvant, FCA)誘發(fā)大鼠AA模型;以GCS和Cat 30,60,120 mg·kg-1治療給藥(ig,d 17~d 24),雷公藤多苷(GTW)40 mg·kg-1為陽性對照。 足容積法測量繼發(fā)側(cè)足腫脹度;進(jìn)行疼痛評分和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎評分;光學(xué)顯微鏡觀察關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化;Ⅱ型膠原酶和胰蛋白酶消化法、組織塊移植法分離培養(yǎng)大鼠的滑膜細(xì)胞;MTT法檢測滑膜成纖維細(xì)胞的增殖反應(yīng);小鼠胸腺細(xì)胞增殖法測定滑膜細(xì)胞產(chǎn)生IL-1水平;放射性免疫法測定滑膜細(xì)胞中TNFα和PGE2含量;放射性免疫法測定滑膜細(xì)胞cAMP水平。采用Western blot技術(shù)檢測滑膜組織和細(xì)胞中EP2、GRK2、β-arrestin1的表達(dá)變化。 結(jié)果: 1. GCS和Cat對AA大鼠具有治療作用 應(yīng)用FCA誘導(dǎo)大鼠AA模型,其繼發(fā)性反應(yīng)表現(xiàn)為以多發(fā)性關(guān)節(jié)炎為特征的關(guān)節(jié)腫脹和觸痛、活動障礙等類似RA的癥狀。病理學(xué)改變可見滑膜組織充血、水腫、增生;淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及少數(shù)散在分布的中性粒細(xì)胞浸潤;血管翳形成;軟骨表層組織變性、壞死;軟骨破壞、肥大、剝脫或斷裂,被纖維血管所取代;膠原纖維增生;骨髓腔內(nèi)骨髓細(xì)胞減少,脂肪細(xì)胞大量增多。 GCS(30,60,120 mg·kg-1)和Cat(60,120 mg·kg-1)治療給藥(ig,d 17~d 24)均可不同程度明顯減輕AA大鼠的繼發(fā)性足腫脹、關(guān)節(jié)疼痛、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎等癥狀;光鏡下觀察關(guān)節(jié)滑膜組織中輕度的滑膜增生、淋巴細(xì)胞浸潤減少;滑膜下有少量纖維增生、血管翳減輕,其中的新生毛細(xì)血管數(shù)量減;軟骨受損程度減輕,僅見少量炎細(xì)胞;骨髓腔中脂肪細(xì)胞明顯減少、骨髓細(xì)胞密集。充分顯示了GCS和Cat對AA大鼠具有治療作用,并且GCS降低多發(fā)性關(guān)節(jié)指數(shù)作用更顯著。 2、GCS和Cat抑制滑膜細(xì)胞分泌PGE2、IL-1、TNFα等炎性細(xì)胞因子,提高胞內(nèi)cAMP水平,抑制滑膜細(xì)胞過度增殖 GCS和Cat體內(nèi)給藥(30,60,120mg/kg, ig, d17-24)可顯著抑制AA大鼠滑膜細(xì)胞培養(yǎng)上清中過高的PGE2、IL-1和TNFα水平,并且GCS對滑膜細(xì)胞分泌PGE2和TNFα的抑制作用更明顯。GCS(30,60,120mg/kg, ig, d17-24)和Cat (60,120mg/kg, ig,d17-24)體內(nèi)給藥、GCS(12.5-100μg/ml)和Cat (25-100μg/ml)體外給藥可抑制AA大鼠FLS的過度增殖,升高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平,相關(guān)性分析表明GCS和Cat抑制AA大鼠FLS的增殖與其提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平密切相關(guān)。IL-1α(10ng·ml-1)刺激使AA大鼠FLS中cAMP水平下降,PGE2水平升高。GCS(12.5~100μg·ml-1)、Cat(12.5~100μg·ml-1)均顯著降低IL-1α刺激的FLS中PGE2水平;GCS(12.5~100μg·ml-1)、Cat(25~100μg·ml-1)均顯著提高IL-1α刺激的FLS中cAMP水平。 3、GCS和Cat上調(diào)AA大鼠滑膜組織EP2受體的表達(dá) AA大鼠滑膜組織中EP2表達(dá)減弱,GCS和Cat體內(nèi)給藥(60,120mg/kg, ig, d17-24)可促進(jìn)EP2的表達(dá),提示調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)EP2受體的表達(dá),恢復(fù)滑膜細(xì)胞EP2-G蛋白-cAMP信號的正常轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是GCS和Cat發(fā)揮抑制滑膜增殖作用的主要機(jī)制之一。 4、GCS和Cat促進(jìn)AA大鼠FLS細(xì)胞膜GRK2及β-arrestin1的表達(dá) Western blot法檢測結(jié)果表明,IL-1α預(yù)處理的AA大鼠成纖維滑膜細(xì)胞GRK2及β-arrestin1蛋白膜表達(dá)量顯著減少,GCS(50,100μg/ml)和Cat (50,100μg/ml)能顯著提高細(xì)胞膜GRK2及β-arrestin1蛋白的表達(dá),提示GCS和Cat通過調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)EP2受體的表達(dá)和脫敏,而保持EP2-G蛋白-cAMP信號的正常轉(zhuǎn)導(dǎo)是其發(fā)揮作用的重要機(jī)制之一。 結(jié)論: 1、GCS和Cat對AA大鼠關(guān)節(jié)局部腫脹、疼痛、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎及病理形態(tài)學(xué)等改變具有明顯的治療作用。 2、GCS和Cat通過抑制滑膜細(xì)胞分泌IL-1、TNFα及PGE2等環(huán)節(jié)而降低AA大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞過高的分泌功能;通過上調(diào)胞內(nèi)的cAMP水平而抑制滑膜細(xì)胞的增殖。 3、GCS和Cat能上調(diào)AA大鼠滑膜組織EP2的表達(dá)。IL-1α可能阻礙了GRK2和β-arrestin1的轉(zhuǎn)膜,從而抑制了EP2受體的脫敏。GCS和Cat通過促進(jìn)AA大鼠成纖維滑膜細(xì)胞膜GRK2及β-arrestin1的表達(dá)而調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)EP2受體的脫敏,表明GCS和Cat可能是通過調(diào)節(jié)EP2-G蛋白-cAMP信號的正常轉(zhuǎn)導(dǎo)而減輕大鼠AA。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2007
【中圖分類】：R593.22;R285
【部分圖文】：

呈長梭形或方柱形，細(xì)胞核呈卵圓型位于細(xì)胞中央，核仁明顯，培養(yǎng)一周左右（圖4-B），細(xì)胞數(shù)目增多，呈長梭狀極向排列逐漸融合成片，將組織塊去除后繼續(xù)培養(yǎng)得到第一代滑膜細(xì)胞。細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶壁 80％左右經(jīng)胰酶消化后進(jìn)行傳代培養(yǎng)（圖 4-C），傳代兩次以上的滑膜細(xì)胞性狀比較穩(wěn)定，細(xì)胞形態(tài)以成纖維樣細(xì)胞為主（圖 4-D）。傳代后模型組細(xì)胞的分裂速度遠(yuǎn)快于正常對照組，分裂呈平行生長，光鏡下細(xì)胞形態(tài)以梭行為主，兩極胞突細(xì)長。圖 4 組織塊培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞形態(tài)的光學(xué)顯微鏡觀察Fig4 Morphological changes of FLS by tissue cultureA BC D
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本文編號：2854532