【目的】神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell,NSC)微環(huán)境是調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化和自我更新的關(guān)鍵。目前對(duì)未成熟腦缺血性損傷中影響神經(jīng)干細(xì)胞微環(huán)境的因素及其作用途徑知之甚少。本課題通過研究未成熟腦缺血后神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化及其微環(huán)境的相關(guān)變化,探討缺血性損傷影響神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的作用途徑,并通過對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌因子影響神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的研究,進(jìn)一步闡明其影響神經(jīng)干細(xì)胞微環(huán)境的信號(hào)通路。此外,通過研究堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)干預(yù)對(duì)未成熟腦缺血后神經(jīng)新生的作用,為早產(chǎn)兒腦損傷的治療探索新的途徑。 【方法】一.采用3日齡新生SD大鼠96只,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組分離并結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈,制備腦缺血模型;對(duì)照組僅分離,不結(jié)扎。兩組大鼠分別于術(shù)后24h、4d、7d、14d處死取腦:1.采用免疫熒光染色方法,觀察缺血對(duì)腦室下區(qū)(subventricular zone,SVZ)不同時(shí)點(diǎn)神經(jīng)干細(xì)胞新生和增殖分化的影響;2.利用基因芯片技術(shù),分析SVZ缺血后基因表達(dá)的變化,尋找缺血性損傷調(diào)控SVZ微環(huán)境變化的信號(hào)通路;3.采用real-time PCR、Western blot方法分別從基因和蛋白水平對(duì)發(fā)現(xiàn)的信號(hào)分子進(jìn)行驗(yàn)證。 二.應(yīng)用transwell共培養(yǎng)系統(tǒng),建立3日齡新生SD大鼠SVZ腦片培養(yǎng)模型,隨機(jī)分為三組:共培養(yǎng)組(血管內(nèi)皮細(xì)胞+腦片)、共培養(yǎng)+siRNA組(血管內(nèi)皮細(xì)胞+腦片+VEGF siRNA)和對(duì)照組(僅培養(yǎng)腦片)。其中血管內(nèi)皮細(xì)胞采用ATCC鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株(bEnd.3,No.CRL-2299~(TM)),siRNA干擾采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。腦片分別培養(yǎng)至第4d、7d、10d:1.采用免疫熒光染色的方法,觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌因子對(duì)腦片中神經(jīng)干細(xì)胞增殖,及其向不同功能神經(jīng)細(xì)胞分化的影響;2.通過基因芯片技術(shù),分析在此過程中血管新生與神經(jīng)新生相關(guān)基因表達(dá)的變化,探討血管內(nèi)皮細(xì)胞影響神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的作用途徑與機(jī)制,并采用real-time PCR方法對(duì)關(guān)鍵信號(hào)分子進(jìn)行驗(yàn)證。 三.通過結(jié)扎3日齡新生SD大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈方法制備腦缺血模型后,隨機(jī)分為治療組(54只)和非治療組(54只)。治療組給予bFGF(10ng/g)側(cè)腦室注射,非治療組注射2μl生理鹽水。另取54只3日齡新生SD大鼠作為假手術(shù)對(duì)照組(僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈,不結(jié)扎,不給予藥物)。三組大鼠分別于術(shù)后第4d、7d、14d獲取腦組織標(biāo)本,采用免疫熒光雙標(biāo)、Western blot和real-time PCR的方法,觀察三組大鼠不同時(shí)點(diǎn)SVZ巢蛋白(Nestin)、NeuN、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和少突膠質(zhì)細(xì)胞NG2蛋白及其mRNA的表達(dá)變化,研究bFGF對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞新生和增殖分化的作用。 【結(jié)果】一.未成熟腦缺血性損傷后:1.腦組織病理切片可見SVZ神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死,細(xì)胞層次紊亂、排列松散,部分神經(jīng)細(xì)胞固縮、胞漿深染、核濃縮,結(jié)構(gòu)不清,以術(shù)后第4d損傷最重;2.免疫熒光標(biāo)記結(jié)果顯示SVZ新生細(xì)胞顯著增加,包括神經(jīng)干細(xì)胞(BrdU+/Nestin+)、神經(jīng)元(BrdU+Tuj1+)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(BrdU+/GFAP+)和少突膠質(zhì)細(xì)胞(BrdU+/O4+)數(shù)目均較對(duì)照組增加(P＜0.01),7d達(dá)高峰;3.基因芯片分析發(fā)現(xiàn),與缺血后SVZ神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化相關(guān)的基因主要涉及VEGF、TGF-β1兩條信號(hào)通路,定量分析結(jié)果顯示VEGF、TGF-β1 mRNA和蛋白表達(dá)在缺血后均增加,7d達(dá)高峰,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。 二.血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)未成熟腦神經(jīng)干細(xì)胞的影響:1.共培養(yǎng)組神經(jīng)干細(xì)胞(Nestin+)明顯增加,在共培養(yǎng)7d達(dá)高峰,并且神經(jīng)元(Tuj1+)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP+)和少突膠質(zhì)細(xì)胞(O4+)數(shù)量亦增加,在共培養(yǎng)10d達(dá)高峰,與對(duì)照組和共培養(yǎng)+siRNA組相比,差異顯著(P＜0.01)。2.與血管和神經(jīng)新生相關(guān)的基因表達(dá)譜變化顯示,共培養(yǎng)組有112個(gè)基因表達(dá)較對(duì)照組2倍以上升高,給予siRNA干預(yù)后,這112個(gè)上調(diào)的基因中有81個(gè)表達(dá)呈2倍以上降低。利用基因芯片顯著性分析方法(significance analysis of microarray,SAM)篩選具有顯著性表現(xiàn)的基因,并利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)將這些差異表達(dá)基因按照信號(hào)通路進(jìn)行映射,發(fā)現(xiàn)顯著性表現(xiàn)的基因主要涉及Notch和Pten信號(hào)通路,這兩條信號(hào)通路與血管新生和神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的調(diào)控有關(guān)。采用real-time PCR方法對(duì)這兩條通路中主要基因進(jìn)行驗(yàn)證,得到與芯片數(shù)據(jù)一致的結(jié)果。 三.未成熟腦缺血損傷后給予bFGF干預(yù)組:1.SVZ病理改變較對(duì)照組明顯減輕;2.SVZ各種新生細(xì)胞(BrdU+)數(shù)量均較對(duì)照組顯著增加,其中新生神經(jīng)干細(xì)胞(BrdU+/Nestin+)在7d達(dá)高峰,而新生的神經(jīng)元(BrdU+/NeuN+)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(BrdU+/GFAP+)和少突膠質(zhì)細(xì)胞(BrdU+/NG2+)在14d達(dá)高峰,與非干預(yù)缺血組相比,差異均有顯著意義(P＜0.01);3.Nestin蛋白和mRNA表達(dá)都在7d達(dá)高峰,NeuN、GFAP和NG2的蛋白和mRNA表達(dá)均在14d達(dá)高峰,與非干預(yù)缺血組相比,差異均有顯著意義(P＜0.01)。 【結(jié)論】1.缺血促進(jìn)未成熟腦SVZ神經(jīng)干細(xì)胞的增殖及其向功能神經(jīng)細(xì)胞的分化;2.VEGF和TGF-β信號(hào)通路參與調(diào)控缺血后神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化,是缺血性損傷影響未成熟腦神經(jīng)干細(xì)胞微環(huán)境的重要途徑;3.血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的可溶性細(xì)胞因子和對(duì)血管新生相關(guān)基因的抑制可影響神經(jīng)干細(xì)胞的微環(huán)境,調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化;4.血管內(nèi)皮細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞的相互作用涉及多條通路,主要與Notch和Pten信號(hào)通路有關(guān);5.bFGF干預(yù)可促進(jìn)未成熟腦缺血后的神經(jīng)新生,可能有助于缺血性損傷后的神經(jīng)修復(fù)。
【學(xué)位單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R748
【部分圖文】：

2.準(zhǔn)備RNA樣品:取2林gRNA樣品，加2川goklview上樣染液，混勻;3.電泳:上樣于膠孔中，100V電壓下電泳至澳酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2一3。m4.紫外透射光下觀察并拍照:凝膠電泳顯示285和18sRNA(圖1一2)。圖1一2瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量

仁明顯;缺血組大鼠SVZ神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死，細(xì)胞層次紊亂、排列松散，部分神經(jīng)細(xì)胞固縮、胞漿深染、核濃縮，結(jié)構(gòu)不清，術(shù)后第4d最重，術(shù)后第7d病理改變逐漸減輕(圖1一6)。圖1一6術(shù)后 4dSVZ腦組織病理變化(HE染色)。al和bl分別為a和b框中的放大圖。缺血組存在廣泛的細(xì)胞水腫、神經(jīng)細(xì)胞壞死和局灶的腦軟化，對(duì)照組無病理變化(a， bB滬100林m;al，blB護(hù)50林m)。二.缺血后Svz神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化為觀察新生細(xì)胞是否為神經(jīng)細(xì)胞，本研究采用免疫組化雙標(biāo)記的方法，BrdU標(biāo)記新生細(xì)胞，Nestln標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞，Tujl標(biāo)記神經(jīng)元，G凡J標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞

圖1一8不同時(shí)點(diǎn)SVZ雙標(biāo)陽性細(xì)胞定量分析。A:BrdU十加estin+細(xì)胞數(shù)目變化，表示新生神經(jīng)干細(xì)胞;B:BrdU+汀uj卜細(xì)胞數(shù)目變化，表示新生神經(jīng)元;C:Brdu+/GFAP+細(xì)胞數(shù)目變化，表示新生星形膠質(zhì)細(xì)胞;D:BrdU+/04+細(xì)胞數(shù)目變化，表示新生少突膠質(zhì)細(xì)胞。數(shù)值以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，*尸<0.01。三.缺血后不同時(shí)點(diǎn)SVZ基因表達(dá)的相關(guān)變化(一)缺血后SVZ基因表達(dá)譜變化為了觀察缺血后SVZ基因表達(dá)變化，從而發(fā)現(xiàn)在促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化中起主要作用的因子，本研究選擇A偽metrixRat2302.0芯片，采用基因芯片技術(shù)觀察缺血后SVZ基因表達(dá)變化。在所觀察的2400個(gè)基因中，缺血后SVZ有82個(gè)基因表達(dá)較對(duì)照組呈3倍以上升高，39個(gè)呈3倍以上的降低。采用基因本體數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneOntology，Go)分析，這些差異基因主要涉及蛋白修飾、免疫和炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的調(diào)控。在這些差異基因中，有21個(gè)基因與細(xì)胞死亡、增殖分化相關(guān)。其中，9個(gè)基因缺血后表達(dá)上調(diào)，12個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(表1一4)。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2848538