第一部分RSV感染氣道上皮細胞株TLR1-10 mRNA表達 目的:為了解TLR家族在RSV誘導(dǎo)氣道上皮細胞炎癥反應(yīng)中的作用,體外培養(yǎng)9HTEo人類氣道上皮細胞株,觀察RSV感染后,9HTEo細胞TLR 1-10 mRNA的表達變化。 方法:RSV以MOI為10感染9HTEo細胞3小時后用半定量RT-PCR檢測TLR1-10 mRNA表達;感染3、6和9小時后用Q-PCR檢測TLR1-10 mRNA的動態(tài)變化,并以UV-RSV作為對照。 結(jié)果:RT-PCR結(jié)果提示RSV感染上皮細胞后TLR2~10 mRNA表達均上調(diào),以TLR2和TLR6變化最為顯著;Q-PCR結(jié)果顯示:(1)9HTEo細胞株可表達TLR1-10 mRNA,其中以TLR4和TLR8 mRNA表達最高;(2) RSV感染上皮細胞6小時和\或9小時后,TLR1-10 mRNA均表達增高,而UV-RSV組TLR1-10mRNA無明顯變化。 結(jié)論:RSV感染氣道上皮細胞株后,TLR1-10 mRNA均被上調(diào),而無復(fù)制能力的RSV不能引起TLR1-10mRNA表達的變化,提示RSV誘導(dǎo)TLRs mRNA表達與病毒入胞復(fù)制有關(guān)。 第二部分RSV感染后氣道上皮細胞株TLR4蛋白表達及其功能研究 目的:觀察RSV感染后,氣道上皮細胞TLR4蛋白表達變化及其信號通路的功能,與RSV在細胞復(fù)制的關(guān)系,進一步探討RSV誘導(dǎo)氣道炎癥的可能機制。 方法:體外培養(yǎng)人類氣管上皮細胞株9HTEo-,RSV以MOI為10感染上皮細胞24小時后(1)用流式細胞術(shù)檢測TLR4表達及與凋亡的關(guān)系;(2)用ELISA檢測RSV感染上皮細胞經(jīng)LPS刺激,并加入TLR4阻斷劑HTA125后,上清液中IL-8,IL-6和RANTES的含量;(3)運用TLR4特異性的siRNA干擾9HTEo細胞TLR4表達后,接種RSV并予以LPS刺激,用ELISA法檢測上清液中IL-8,IL-6的水平。用TLR4特異性siRNA干擾9HTEo細胞24小時后,①RSV以MOI為0.1感染細胞,連續(xù)3天收集上清液用Adeasy TCID50法檢測RSV感染性滴度的變化;②RSV以MOI為10感染細胞48小時,ELISA方法檢測上清液中IL-8,IL-6,TNF-α和MCP-1的變化;③RSV以MOI為10感染細胞24小時后,用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。 結(jié)果:RSV感染9HTEo上皮細胞,膜上TLR4表達增高而胞內(nèi)TLR4表達降低,TLR4陽性細胞百分比明顯增加,其中絕大部分為膜Annexin V陽性細胞;LPS誘導(dǎo)的IL-6和部分IL-8可被HTA125阻斷,RANTES無明顯變化;在TLR4表達被干擾的情況下,LPS刺激僅能誘導(dǎo)產(chǎn)生部分IL-8,不能誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6。TLR4-siRNA組的RSV滴度變化與正常9HTEo細胞組無統(tǒng)計學(xué)差異;RSV誘導(dǎo)的IL-6和MCP-1水平在TLR4-siRNA 200nM組明顯低于對照組,而IL-8和TNF-α的水平無明顯變化;TLR4-siRNA組RSV誘導(dǎo)AnnexinV陽性同時PI陰性的細胞群體百分比在TLR4-siRNA組明顯高于對照細胞組。 結(jié)論:RSV感染9HTEo細胞后,LPS再刺激產(chǎn)生IL-6是依賴于TLR4信號通路。氣道上皮細胞TLR4通路與RSV復(fù)制、RSV誘導(dǎo)上皮細胞分泌IL-8無關(guān),但與病毒誘導(dǎo)上皮細胞分泌IL-6和MCP-1,以及病毒感染細胞發(fā)生凋亡有關(guān)。 第三部分RSV感染后氣道上皮細胞株TLR3蛋白的表達及其功能研究 目的:觀察RSV感染9HTEo上皮細胞后, TLR3蛋白表達變化及其信號通路的功能。 方法:體外培養(yǎng)人類氣管上皮細胞株9HTEo-,RSV(1)以MOI為1感染上皮細胞24小時后,提取細胞總蛋白,用Westernblot的方法檢測TLR3表達的變化,以TLR3激動劑PolyIC刺激為對照;(2)以MOI為10接種上皮細胞4小時后,直接加入PolyIC到培養(yǎng)上清或用脂質(zhì)體將PolyIC轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)刺激48小時后,用ELISA檢測上清液中IL-8,IL-6, IFN-α和IFN-β的表達。 結(jié)果:RSV感染后9HTEo上皮細胞后,TLR3蛋白表達量明顯增高,再經(jīng)胞內(nèi)TLR3激動劑PolyIC刺激后,培養(yǎng)上清IL-8,IL-6和IFN-β含量明顯增加。 結(jié)論:RSV誘導(dǎo)上皮細胞TLR3蛋白表達增高,TLR3通路可介導(dǎo)IL-8和IL-6和少量IFN-β產(chǎn)生,提示TLR3通路可能主要誘導(dǎo)上皮細胞炎癥反應(yīng)而不是抗病毒反應(yīng)。 第四部分白藜蘆醇抑制RSV感染氣道上皮細胞株炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生及其機制研究 目的:以地塞米松和利巴韋林為對照,觀察白藜蘆醇對RSV復(fù)制和對RSV誘導(dǎo)的上皮細胞炎癥反應(yīng)作用及其機制研究。 方法:(1)體外培養(yǎng)人類氣管上皮細胞株9HTEo-細胞和Hep-2細胞株,RSV以MOI為0.1接種Hep-2細胞和9HTEo細胞4小時后,加入適宜濃度的白藜蘆醇,地塞米松和利巴韋林,連續(xù)5天收集各組上清液,用AdeasyTCID50方法檢測計算RSV滴度的變化;(2)體外培養(yǎng)人類氣管上皮細胞株9HTEo-細胞,RSV以MOI為10接種9HTEo細胞4小時,將PolyIC轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)后再加入適宜濃度白藜蘆醇,地塞米松或利巴韋林至48小時后,用ELISA檢測上清液中IL-8,IL-6的表達。(3)體外培養(yǎng)人類氣管上皮細胞株9HTEo-細胞,RSV以MOI為1接種9HTEo細胞4小時,加入適宜濃度白藜蘆醇,地塞米松或利巴韋林,48小時后收集細胞提取蛋白用Westernblot檢測TLR3蛋白,TRIF蛋白和TBK-1蛋白表達的變化。 結(jié)果:Hep-2細胞-白藜蘆醇100μM處理組和9HTEo細胞-白藜蘆醇處理組的RSV滴度明顯低于單純RSV組,相應(yīng)細胞的地塞米松處理組的RSV滴度無明顯變化,而利巴韋林組的RSV滴度明顯低于單純RSV組。RSV感染9HTEo細胞后,白藜蘆醇組和地塞米松組的IL-6水平明顯降低,但IL-8無明顯變化,利巴韋林組的IL-8和IL-6水平明顯降低;RSV感染9HTEo細胞后再給與胞內(nèi)PolyIC刺激后,白藜蘆醇組,地塞米松組的IL-8和IL-6水平均明顯降低,而利巴韋林組IL-8和IL-6無明顯變化。RSV感染9HTEo細胞后,白藜蘆醇處理組的TRIF蛋白和TBK-1蛋白表達明顯降低,TLR3蛋白無明顯變化;地塞米松組和利巴韋林組的TLR3蛋白,TRIF蛋白和TBK-1蛋白的表達均明顯降低。 結(jié)論:白藜蘆醇可抑制RSV在氣道上皮細胞中的復(fù)制和抑制dsRNA-TLR3通路的TRIF蛋白和TBK-1蛋白表達,從而抑制RSV誘導(dǎo)上皮細胞分泌的IL-6,提示白藜蘆醇抑制RSV感染后氣道炎癥反應(yīng)的作用。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R725.6
【部分圖文】：

RSV 核酸 RT-PCR 產(chǎn)物本 2：陽性對照 3：陰phresis of RSV nucleotiPositive Control 3：繁殖的 RSV 滴度，根稀釋度病毒感染后細ication manual （ver選擇偏小值計算 TCD50/ml。

圖 1-2 TCID50 法檢測 RSV 滴度（A：106.5TCID50/ml B：106.7TCID50/mFig 1-2 RSV titration by TCID50 assay (A：106.5TCID50/ml B：106.7TCID502.1.2 RSV 病毒感染 9HTEo 上皮細胞株氣道上皮細胞是 RSV 復(fù)制的靶細胞，而我們選用的細胞株來源于人類皮細胞，因此首先我們需要確定 RSV 能否感染 9HTEo 細胞。RSV 以 MO感染 9HTEo 細胞感染 24 小時后，顯微鏡下觀察可見明顯的細胞融合病變熒光免疫法也可檢測到細胞內(nèi)可見綠色熒光，說明 RSV 病毒能夠感染 9H胞株，而 UV-RSV 接種的細胞無明顯病變。

RSV染 9HTEo 細胞后的細胞病變和直接熒光免疫檢測結(jié)pathological effect of RSV-infected 9HTEo cells anddetection by direct fluorescent assay (×100 )TEo 上皮細胞株 3 小時后 TLR1-10 m示 9HTEo 細胞株可表達 TLR1~10，TLR1 表K）TLR mRNA 表達，凝膠成像可見 RSV 組R4 的其余 TLR 條帶亮度增強，mRNA 表達呈最為明顯。1 23456 789101112
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本文編號：2845873