第一部分持續(xù)驚厥發(fā)作后影響海馬神經(jīng)元凋亡早期信號傳導的相關因素研究 目的:探討年齡和驚厥持續(xù)時間對驚厥持續(xù)狀態(tài)(Status Convulsion,SC)后不同齡期大鼠海馬細胞線粒體膜電位(△Ψm)和細胞色素C(Cytochrome,cytC)釋放的影響。 方法:健康成年(ARs)和生后20d幼年Wistar鼠(IRs)各80只,經(jīng)腹腔注射氯化鋰—匹羅卡品分別誘發(fā)持續(xù)驚厥發(fā)作30分鐘的SC (30′SC)和3小時的SC(3h SC),在SC后3h至7d的6個不同時點上處死動物,采用流式細胞儀(Flow Cytometer,FCM)檢測海馬細胞線粒體△Ψm和cytC含量,比較兩組間的動態(tài)變化。 結(jié)果:(1)30′SC后3h,兩組線粒體△Ψm即開始降低,均于SC后6h降至最低點,分別為6.08±0.43和5.70±0.63,顯著低于對照組(P0.01)。(2)30′SC后7d幼年組海馬細胞線粒體△Ψm已升至正常對照水平,而成年組卻呈緩慢回升趨勢,SC后7d仍遠低于正常對照組(P0.05)。在SC后3h,3d,7d,幼年組海馬細胞線粒體△Ψm顯著高于成年組(P0.05)。(3)3h SC后,兩組海馬細胞線粒體△Ψm均顯著低于30′SC后的相同觀察時點(P0.05)。(4)偏相關參數(shù)分析,在排除年齡的影響后,SC后海馬細胞線粒體△Ψm降低的程度與驚厥持續(xù)時間呈正相關(r=0.71,P0.05)。(5)不同年齡及不同時程SC后海馬cytC的變化與線粒體△Ψm的變化趨勢類似。 結(jié)論:(1)嚴重驚厥發(fā)作可導致海馬細胞線粒體△Ψm降低及cytC的釋放。(2)年齡和驚厥持續(xù)時間均是影響海馬細胞凋亡早期事件變化的重要因素。(3)幼年鼠海馬細胞凋亡早期事件的變化較成年鼠明顯為輕,并迅速恢復,提示幼年腦內(nèi)存在一個主動抑制海馬細胞凋亡早期事件變化的保護性反應。 第二部分未成熟腦對驚厥性腦損傷相對耐受性的分子調(diào)控機理研究 目的:探索SC后不同齡期大鼠海馬細胞凋亡調(diào)控基因bcl-2和c-jun表達的年齡差異性。 方法:健康ARs和IRs各80只,經(jīng)腹腔注射氯化鋰—匹羅卡品分別誘發(fā)持續(xù)驚厥發(fā)作30分鐘的SC (30′SC)和3小時的SC(3h SC),在SC后3h至7d的6個不同時點上處死動物,采用免疫組化觀察海馬bcl-2和c-jun蛋白的分布,并進行半定量分析,采用RT-PCR和原位雜交測定bcl-2和c-jun mRNA的表達。 結(jié)果:(1)正常情況下,幼年鼠海馬c-jun蛋白表達較成年鼠明顯為高(P0.05)。30′SC后3h,幼年鼠和成年鼠海馬c-jun蛋白表達即開始升高,均于SC后6h達到高峰,分別為0.158±0.024和0.225±0.028,顯著高于正常對照,12h后開始回落。30′SC后1d,幼年鼠c-jun蛋白表達已降至正常對照水平;而成年鼠直至SC后7d仍顯著高于正常對照水平。(2)SC后成年鼠海馬c-jun蛋白表達較幼年鼠更為明顯,SC后6h反超幼年鼠,SC后6h至7d的5個時點均顯著高于幼年組。(3)3h SC后,兩組海馬c-jun蛋白表達均顯著高于30′SC后的相同觀察時點。(4)偏相關參數(shù)分析,在排除年齡的影響后,SC后海馬c-jun蛋白的表達與驚厥時程呈正相關(r=0.78,P0.05)。(5)不同時程SC后兩組c-jun mRNA的表達與上述類似。(6)30′SC和3h SC后幼年鼠及成年鼠海馬bcl-2蛋白/mRNA表達升高不明顯,兩年齡組間比較或與正常對照比較,均無明顯差異性。 結(jié)論:(1)嚴重驚厥發(fā)作將誘導海馬凋亡促進基因c-jun的表達增高。(2)年齡和驚厥持續(xù)時間均是影響驚厥后海馬c-jun表達的重要因素。驚厥持續(xù)時間越長,海馬c-jun表達越明顯。(3)SC后幼年鼠海馬c-jun的表達較成年鼠明顯為弱,且持續(xù)時間短,這可能是未成熟腦抵抗驚厥性腦損傷的機制之一。(4)無論在幼年鼠或成年鼠,SC均不能明顯誘發(fā)凋亡抑制基因bcl-2的強表達,SC后bcl-2的表達受年齡及驚厥持續(xù)時間的影響小。 第三部分BDNF對驚厥性腦損傷的作用及其調(diào)控機理研究 目的:觀察外源性腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-Derived Neurotrophic Factor,BDNF)對SC后海馬細胞凋亡早期事件(線粒體△Ψm、cytC)和凋亡調(diào)控基因(bcl-2、c-jun)的影響,并探索其可能的作用機制。 方法:選用成年Wistar鼠,制作氯化鋰-匹羅卡品SC模型,經(jīng)腦室內(nèi)注射BDNF、抗BDNF抗體及抗磷酸化cAMP反應元件結(jié)合蛋白(Phosphorylated cAMP Response Element-binding Protein,pCREB)抗體,于注射后6小時處死動物,用FCM檢測海馬細胞線粒體△Ψm和cytC含量;免疫組化、RT-PCR和原位雜交觀察海馬bcl-2、c-jun蛋白和相應mRNA的變化。 結(jié)果:(1)經(jīng)正常大鼠側(cè)腦室注射NS后,與無注射對照相比,注射側(cè)海馬細胞線粒體△Ψm顯著降低、cytC含量明顯增高。SC后,與NS注射側(cè)相比,BDNF注射側(cè)海馬細胞線粒體△Ψm明顯升高(P0.05)、cytC的含量顯著降低(P0.01),而抗BDNF抗體和抗pCREB抗體注射側(cè)海馬細胞凋亡早期事件卻呈現(xiàn)相反變化(P0.05)。與同組無注射對照組相比,BDNF注射對側(cè)海馬細胞凋亡早期事件無明顯變化(P0.05)。(2)在正常情況下,大鼠一側(cè)腦室內(nèi)注射(NS、BDNF、抗BDNF抗體或抗pCREB抗體)后,注射側(cè)海馬bcl-2及c-jun表達與同組無注射對照比較差異無顯著性。在SC組,BDNF注射側(cè)海馬bcl-2表達顯著高于同組無注射對照組和NS注射組(P 0.05),抗BDNF抗體及抗pCREB抗體注射側(cè)則較NS注射組顯著降低(P0.05);而c-jun表達則呈相反變化趨勢。(3)在正常狀態(tài)及SC組,BDNF注射對側(cè)海馬bcl-2及c-jun表達與同組無注射對照組相比無顯著性差異。 結(jié)論:(1)SC后腦室內(nèi)注射外源性BDNF可上調(diào)凋亡抑制基因bcl-2表達,而下調(diào)凋亡促進基因c-jun表達,抑制線粒體△Ψm的改變及cytC的釋放,從凋亡過程上游關鍵環(huán)節(jié)對驚厥性腦損傷產(chǎn)生一定抑制作用。(2)SC后腦室內(nèi)注射外源性抗pCREB抗體,阻斷CREB的磷酸化,可能通過抑制神經(jīng)元BDNF表達,或直接削弱CREB本身的作用,從而加重驚厥性腦損傷。(3)腦室內(nèi)注射BDNF在腦內(nèi)擴散有限,并可誘導注射部位神經(jīng)細胞損傷。因此,腦室內(nèi)直接注射方法在臨床的應用受限。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2006
【中圖分類】：R720.597
【部分圖文】：

圖 2-1 正常幼年大鼠海馬齒狀回及 CA3 區(qū) bcl-2 免疫組化陽性細胞（×100）Fig 2-1 Immunostaining for bcl-2 in nomal infantrat hippocampus, including the dentategyrus and the CA3 regions (×100)圖 2-2 正常成年大鼠海馬齒狀回及 CA3 區(qū)bcl-2 免疫組化陽性細胞(×100)Fig 2-2 Immunostaining for bcl-2 in nomaladult rat hippocampus, including thedentate gyrus and the CA3 regions(×100)圖 2-5 正常幼年大鼠海馬齒狀回 c-jun 免疫組化陽性細胞(×400）Fig 2-5 Immunostaining for c-jun in nomal infantrat hippocampal dentate gyrus (×400)圖2-6 正常成年大鼠海馬齒狀回c-jun免疫組化陽性細胞(×400)Fig 2-6 Immunostaining for c-jun in nomaladult rat hippocampal dentate gyrus(×400)

圖 2-1 正常幼年大鼠海馬齒狀回及 CA3 區(qū) bcl-2 免疫組化陽性細胞（×100）Fig 2-1 Immunostaining for bcl-2 in nomal infantrat hippocampus, including the dentategyrus and the CA3 regions (×100)圖 2-2 正常成年大鼠海馬齒狀回及 CA3 區(qū)bcl-2 免疫組化陽性細胞(×100)Fig 2-2 Immunostaining for bcl-2 in nomaladult rat hippocampus, including thedentate gyrus and the CA3 regions(×100)圖 2-5 正常幼年大鼠海馬齒狀回 c-jun 免疫組化陽性細胞(×400）Fig 2-5 Immunostaining for c-jun in nomal infantrat hippocampal dentate gyrus (×400)圖2-6 正常成年大鼠海馬齒狀回c-jun免疫組化陽性細胞(×400)Fig 2-6 Immunostaining for c-jun in nomaladult rat hippocampal dentate gyrus(×400)

圖片資料圖 2-1 正常幼年大鼠海馬齒狀回及 CA3 區(qū) bcl-2 免疫組化陽性細胞（×100）Fig 2-1 Immunostaining for bcl-2 in nomal infantrat hippocampus, including the dentategyrus and the CA3 regions (×100)圖 2-2 正常成年大鼠海馬齒狀回及 CA3 區(qū)bcl-2 免疫組化陽性細胞(×100)Fig 2-2 Immunostaining for bcl-2 in nomaladult rat hippocampus, including thedentate gyrus and the CA3 regions(×100)
【參考文獻】

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本文編號：2845861