目的 腸神經(jīng)元異常性疾病(Neuronal intestinal malformation,NIM)是一類腸神經(jīng)分布、質(zhì)量異常導(dǎo)致腸功能障礙而影響人們健康的常見疾病,主要臨床表現(xiàn)為慢性便秘、小腸結(jié)腸炎等。以往研究集中在先天性發(fā)育障礙導(dǎo)致的無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥即先天性巨結(jié)腸(HD)及巨結(jié)腸類緣病(HAD),已有報(bào)道先天性肛門直腸畸形(anorectalmalformation,ARM)患兒的腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system,ENS)發(fā)育也存在異常,近年來發(fā)現(xiàn)年長兒及成年后有腸神經(jīng)元異常改變,缺血、感染、毒素等因素導(dǎo)致腸神經(jīng)變性可能是后天性腸神經(jīng)元異常的重要因素。究竟如何出現(xiàn)ENS異常,一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域探究熱點(diǎn),病因機(jī)制至今仍不明確。近期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)在鼠胚胎期器官發(fā)育和神經(jīng)發(fā)育過程中起重要作用。本課題應(yīng)用免疫組化、PCR以及Western blot技術(shù)研究血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)與BMPs在人類NIM腸管表達(dá),探討在ENS發(fā)育過程中可能的作用,并進(jìn)行缺血與神經(jīng)病變相關(guān)性研究。通過建立腸神經(jīng)元異常大鼠模型,應(yīng)用常規(guī)HE染色觀察大鼠結(jié)腸遠(yuǎn)端神經(jīng)節(jié)的病理性改變,檢測其腸組織和神經(jīng)組織中活性氧、丙二醛、谷胱甘肽及總抗氧化能力等脂質(zhì)過氧化指標(biāo)變化,以期為揭示NIM的病因與發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法 本研究標(biāo)本取自山東大學(xué)附屬醫(yī)院外科,2006～2008年經(jīng)病理證實(shí)的62例NIM患者。其中HD狹窄段為無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段,移行段為查見有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段,擴(kuò)張段為接近神經(jīng)節(jié)細(xì)胞正常段。分別取兩份新鮮標(biāo)本放入無菌試管置于-80℃冰箱中保存,另取一份用10%福爾馬林固定,常規(guī)行蠟塊包埋HE染色。按不同年齡分為新生兒組、幼兒組及年長組,并選無肛腸疾病32例為正常對(duì)照組。 分別對(duì)NIM病變段及正常段腸壁組織進(jìn)行HE常規(guī)染色及免疫組織化學(xué)染色,使用RSImage成像系統(tǒng)照相并存盤,利用圖像分析軟件判定VEGF,BMP—2,BMP—4陽性染色面積,用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件單因素方差分析分別對(duì)VEGF,BMP平均光密度(MOD)分析比較;用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)目的蛋白在病變段及正常段腸壁組織的表達(dá)從基因水平定量分析,對(duì)VEGF基因,BMP—2,BMP—4基因及內(nèi)參基因的Ct值采用7500型SDS應(yīng)用軟件計(jì)算相對(duì)定量2~(-ΔΔCt)比較表達(dá)差異;用Western blot技術(shù)對(duì)VEGF,BMP—2,BMP—4的表達(dá)從蛋白水平進(jìn)行定量分析。 Wistar雄性大鼠(體重為180～220g,由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)隨機(jī)分為兩組,即實(shí)驗(yàn)組(n=40)和相應(yīng)時(shí)間匹配的對(duì)照組(n=50)。為確定腸神經(jīng)病變和脂質(zhì)過氧化的變化,二硫化碳(CS2)吸入按大鼠1250 mg/m~3持續(xù)12周,對(duì)照組給予相同劑量的空氣。分別在0、2、4、8和12周,從對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取10只大鼠,迅速取出腸組織、大腦、海馬和脊髓神經(jīng)組織,投入液氮中-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩４蜷_大鼠腹腔后取結(jié)腸遠(yuǎn)端2cm腸管,10%甲醛溶液固定、編號(hào),待組織觀察。蛋白含量由專用蛋白定量試劑盒測定,分別測定大鼠腸組織、大腦皮質(zhì)、海馬、脊髓和血清中活性氧、丙二醛、谷胱甘肽、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和總抗氧化能力的變化。所有的脂質(zhì)過氧化指標(biāo)均在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別測定。 結(jié)果 1.免疫組織化學(xué)結(jié)果 陽性染色點(diǎn)為棕黃色顆粒,VEGF主要分布于粘膜腺體、粘膜下血管區(qū)及肌層,神經(jīng)節(jié)內(nèi)亦可見到。BMP在粘膜層、粘膜下層及肌層均可見表達(dá),在腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)也有表達(dá),從粘膜層到肌層呈梯度遞減。粘膜層、粘膜下層腺體及基底膜連續(xù)黃染,平滑肌呈纖維網(wǎng)狀,病變段可見點(diǎn)狀棕黃色顆粒,正常段黃染明顯加強(qiáng)。BMP-2與BMP-4染色強(qiáng)弱分布趨勢基本一致。 對(duì)平均光密度分析比較,VEGF在病變表達(dá)比正常段明顯降低(P＜0.05),從正常段到病變段遞減。BMP-2,-4在病變表達(dá)比正常段明顯降低(P＜0.05),在各段腸管縱肌、環(huán)肌和粘膜肌層平滑肌細(xì)胞中表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在HD移行段、狹窄段神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的分布與正常對(duì)照組相比差異有顯著性意義(P＜0.05),呈不同程度的降低,但在擴(kuò)張段與正常對(duì)照組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在其余各組病變段與正常對(duì)照差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。BMP-2及BMP-4分布表達(dá)趨勢基本一致。 各年齡組中在狹窄段、移行段分別與擴(kuò)張段比差異有顯著性意義(P＜0.05),不論年長組還是幼兒組正常段,與新生兒組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),但不同年齡組狹窄段、移行段與新生兒組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果 VEGF,BMP—2,BMP—4基因在HD狹窄段表達(dá)分別是擴(kuò)張段的0.09倍,0.07倍、0.19倍,移行段是擴(kuò)張段的0.21倍,0.22倍,0.33倍,從擴(kuò)張段至狹窄段逐漸減低。年長組較新生兒組正常對(duì)照基因表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),隨年齡增長表達(dá)均呈下降趨勢,表達(dá)同時(shí)具有空間位相性與時(shí)相性。VEGF與BMP-2,-4基因表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.586,r=0.621,P＜0.01),BMP-2與BMP-4的表達(dá)也呈正相關(guān)(r=0.762,P＜0.01)。其余各組病變段與正常對(duì)照同樣差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 3.Western blot結(jié)果 VEGF,BMP—2,BMP—4蛋白在HD移行段、狹窄段表達(dá)呈不同程度的降低,與正常段比差異均有顯著性意義(P＜0.05)。在擴(kuò)張段表達(dá)與正常段差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。VEGF,BMP—2,BMP—4蛋白在年長組、幼兒組擴(kuò)張段表達(dá)較新生兒組表達(dá)下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),目的蛋白表達(dá)同樣具有空間位相性與時(shí)相性。 4.腸神經(jīng)病變大鼠脂質(zhì)過氧化的變化 實(shí)驗(yàn)組大鼠結(jié)腸HE染色顯示腸神經(jīng)節(jié)體積膨脹,胞漿染色變淡,出現(xiàn)空泡樣變性,甚至細(xì)胞數(shù)量減少。ROS含量在腸組織、大腦皮質(zhì)、海馬、脊髓和血清中明顯升高。腸神經(jīng)中2、4、8和12周分別升高了11.8%、34.9%、38.5%和42.7%(P＜0.01),大腦皮質(zhì)中4、8和12周分別升高了19.0%、30.5%和31.55%,脊髓中在8和12周分別是對(duì)照組的134.7%和164.4%,與對(duì)照組相比血清中ROS含量在4、8和12周分別升高了71.9%、85.3%和87.9%(P＜0.01)。腸組織MDA含量在2、4、8和12周分別升高了33.3%、52.4%、66.7%和76.2%(P＜0.01),大腦皮質(zhì)分別增加到相應(yīng)對(duì)照組的117.1%、122.2%、128.6%和134.8%,血清也顯示分別升高了14.0%、19.0%、33.0%和53.6%(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)組腸組織、大腦皮質(zhì)、海馬、脊髓和血清中GSH-Px活性明顯降低,12周后分別下降24.8%、18.2%、29.9%、16.2%和33.3%。GSH、CAT和T-AOC活性也下降,GSH含量和CAT、T-AOC活性在腸神經(jīng)分別在4、2和4周開始下降,大腦皮質(zhì)中8、8和2周開始下降,海馬中在8、2和2周降低,脊髓中-、8和8周下降(-表示無變化),血清中在8、4和8周降低。12周后GSH含量和CAT、T-AOC活性在腸組織下降9.1%,20%,19.4%;大腦皮質(zhì)中分別下降15.2%、22.6%和23.6%;在海馬中分別下降25.6%、46.4%和32.3%;在脊髓中分別下降-2.2%(P＞0.05),35.0%和15.5%;血清中分別下降16.3%、48.6%和30.7%。但是SOD活性升高,12周后在腸組織、大腦皮質(zhì)、海馬、脊髓和血清中升高20.8%、31.5%、44.4%、64.4%和12.1%(P＜0.01)。 實(shí)驗(yàn)組大鼠腸組織、大腦皮質(zhì)、海馬、脊髓和血清中活性氧、丙二醛的含量明顯增加,并有明顯的時(shí)間依賴性。在2、4、8和12周谷胱甘肽濃度和谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶活性均明顯下降,總抗氧化能力也明顯降低。氧化應(yīng)激同時(shí)也導(dǎo)致了神經(jīng)組織中Ca~(2+)濃度和鈣調(diào)蛋白含量明顯升高。 結(jié)論 VEGF、BMP—2,—4在人類ENS中存在表達(dá),在NIM病變腸管表達(dá)異常,呈現(xiàn)明顯降低,年長組較新生兒組表達(dá)呈下降趨勢,表達(dá)同時(shí)具有時(shí)相性與空間位相性。目的蛋白的表達(dá)是內(nèi)在的,可能參與引起腸壁神經(jīng)嵴細(xì)胞(NCC)過早分化、遷移、成熟導(dǎo)致IGC異常,提示與NIM發(fā)生的發(fā)病有關(guān),兩者表達(dá)又互相影響呈正相關(guān),對(duì)NIM形成可能存在內(nèi)在的聯(lián)系。實(shí)驗(yàn)組大鼠腸神經(jīng)節(jié)形態(tài)學(xué)異常,其腸組織中活性氧、丙二醛的含量明顯增加,過氧化增強(qiáng)同時(shí)抗氧化能力降低,表明脂質(zhì)過氧化可能對(duì)抗BMP引起神經(jīng)損傷,至少部分介導(dǎo)了腸神經(jīng)異常的發(fā)生。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R726.5
【部分圖文】：

2.2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定目的基因 2.2.1.1VEGF，BMP一2，BMP一4基因及內(nèi)參p一actin基因mRNA水平擴(kuò)增曲線。在熒光定量PCR過程中，以熒光值和循環(huán)數(shù)作圖，自動(dòng)獲得如下擴(kuò)增曲線(圖6，了)�？梢钥闯鰳悠分貜�(fù)性較好，各樣品擴(kuò)增效率比較一致。Rn業(yè).C業(yè)d.圖6實(shí)時(shí)熒光定量 PCRvEGF，B淤一2，BMP一4基因及p一actin表達(dá)圖7實(shí)時(shí)熒光定量PCRV明F，BMP一2，BMP一4基因及p一actin擴(kuò)增曲線

BMP一2，BMP一4基因及內(nèi)參p一actin基因產(chǎn)物的降解曲線2.2.1.3VEGF，BMP一2，BMP一4的基因表達(dá)根據(jù)不同部位VEGF基因及內(nèi)參p一a。tin基因表達(dá)的平均Ct值，采用7500SDS件分析系統(tǒng)，按公式2一乙乙ct計(jì)算相對(duì)定量RQ值(relativequantification)，判定基因的達(dá)差異。VEGF基因在HD狹窄段表達(dá)是擴(kuò)張段的0.09倍，移行段是擴(kuò)張段的0.21倍，從擴(kuò)張段至狹窄段VEGF基因表達(dá)水平逐漸減低(表11)。根據(jù)不同部位BMP一2，BMP一4基因及內(nèi)參p一actin基因表達(dá)的平均Ct值，采相對(duì)定量2一乙乙ct計(jì)算RQ值，判定基因的表達(dá)差異。BMP一2，BMP一4基因在HD狹窄段達(dá)分別是擴(kuò)張段的0.07倍、0.19倍，移行段是擴(kuò)張段的0.22倍、0.33倍，從擴(kuò)張至狹窄段逐漸減低(表12，13)。年長組較新生兒組擴(kuò)張段基因表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)意義(尸切.05)，隨年齡增長表達(dá)均呈下降趨勢，目的基因表達(dá)不僅具時(shí)相性，有

BMP一4在其它腸神經(jīng)異常疾病組的表達(dá)(x士S)
【參考文獻(xiàn)】

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