發(fā)布時間：2020-10-12 16:42

　　 【目的】建立早產(chǎn)新生大鼠高氧暴露肺損傷動物模型,觀察高氧對早產(chǎn)鼠肺組織形態(tài)學影響,研究早產(chǎn)新生大鼠在高氧肺損傷肺組織中凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1)和硫氧還蛋白(thioredoxin reductase ,Trx)及其還原酶(thioredoxin reductase,TrxR)的表達變化及意義,探討高氧肺損傷的發(fā)病機制和防治措施。 【方法】早產(chǎn)新生SD大鼠128只,生后1d隨機分為空氣組和高氧組,每組64只。高氧組持續(xù)暴露于氧濃度為85%的氧箱內(nèi),空氣組置于常壓空氣中。兩組分別于空氣或高氧暴露后1 d、4 d、7 d、10 d和14 d時,用10%烏拉坦腹腔注射使之麻醉,提取各組早產(chǎn)鼠肺組織,采用HE染色觀察肺組織病理學變化;提取各組肺組織總RNA和總蛋白,采用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測Trx和TrxR mRNA表達;免疫組織化學方法檢測肺組織ASK1蛋白的表達和分布,Western blot法檢測肺組織ASK1蛋白表達水平變化。 【結(jié)果】(1)肺組織病理學觀察:與對照組比較,高氧組早產(chǎn)大鼠肺組織出現(xiàn)明顯肺泡炎性改變和肺發(fā)育滯后。(2)免疫組織化學染色結(jié)果顯示,在早產(chǎn)大鼠肺組織ASK1廣泛分布于肺泡上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞胞漿中;高氧暴露1 d、4 d的肺組織ASK1蛋白表達分別0.4382±0.0227和0.5270±0.0432,明顯高于空氣組(0.3458±0.02630和0.3760±0.0058)(P0.01),7 d時下降為0.4343±0.0254,但仍高于空氣組(0.3473±0.0220)(P0.01)。(3)高氧組Trx和TrxR mRNA表達強度均明顯高于空氣組,且二者分別于10 d(0.6860±0.0811)和7 d(2.0351±0.1600)時達高峰(P0.05)。(4)Western blot法檢測ASK1蛋白水平變化與免疫組織化學法結(jié)果一致。 【結(jié)論】高氧暴露可誘導早產(chǎn)大鼠肺組織發(fā)生廣泛炎癥反應,并使肺發(fā)育滯后;ASK1參與了高氧肺損傷的發(fā)生發(fā)展;而Trx系統(tǒng)可能在其中發(fā)揮重要保護作用。 【目的】研究高氧暴露對胎鼠肺泡二型上皮細胞(typeⅡalveolar epithelial cell,AECⅡ)硫氧還蛋白(thioredoxin,Trx)及其還原酶(thioredoxin reductase,TrxR)表達的影響及意義。 【方法】采用胰酶和膠原酶消化19d的胎鼠肺組織塊,按照差速離心和反復貼壁法,無菌分離、純化、原代培養(yǎng)胎鼠AECⅡ,待其生長至亞融合狀態(tài)時,隨機分為空氣組和高氧組;于培養(yǎng)箱內(nèi)靜置30min后,空氣組置于同一室內(nèi)空氣中,高氧組通10分鐘的850mL/L以上純氧;然后密封培養(yǎng)瓶,置二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。二組分別于培養(yǎng)12h、24h和48h時,倒置相差顯微鏡下觀察高氧對細胞形態(tài)及活性的影響;采用流式細胞術檢測細胞ROS變化及細胞凋亡情況;采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)方法檢測二組各時間點Trx和TrxR mRNA,Trx1和TrxR1 mRNA的表達;采用western blot檢測胎鼠AECⅡ二組各時間點Trx及Trx1表達變化。 【結(jié)果】與空氣組比較,高氧暴露各時間點隨時間延長AECⅡ細胞生長狀態(tài)明顯不良,懸浮細胞增多;高氧暴露各時間點細胞內(nèi)ROS生成及凋亡細胞明顯增加(P 0.01);RT-PCR結(jié)果顯示高氧暴露12 h和24 h后AECⅡ的Trx、TrxR mRNA和Trx1、TrxR1 mRNA表達增加(P 0.05),48 h后二組表達差異無統(tǒng)計學意義(P 0.05);western blot結(jié)果顯示Trx和Trx1蛋白表達變化與mRNA有相同變化趨勢(P 0.05)。 【結(jié)論】高氧暴露使早產(chǎn)大鼠AECⅡ產(chǎn)生過量ROS從而導致AECⅡ細胞損傷和凋亡;高氧暴露可促使胎鼠AECⅡTrx及TrxR的mRNA表達上調(diào);也可誘導Trx蛋白表達增加,提示Trx系統(tǒng)的表達上調(diào)對高氧誘導的肺泡二型上皮細胞損傷具有重要保護作用。 【目的】研究抑制人肺腺癌A549肺泡二型上皮細胞硫氧還蛋白(Trx)表達后對高氧暴露A549細胞包括信號級聯(lián)通路的直接影響。 【方法】體外培養(yǎng)傳代A549細胞,在轉(zhuǎn)染siNT或者siTrx 48 h后分別被隨機分成空氣組和高氧組�？諝鈨山M置于空氣中,高氧兩組通以600mL.L-1中等濃度高氧。分別培養(yǎng)12 h后收獲細胞,采用流式細胞術檢測各組肺泡二型上皮細胞內(nèi)活性氧水平及細胞凋亡數(shù)量;用western blot法檢測MAPKs信號通路中三個亞家族蛋白的磷酸化程度及PI3K/Akt信號通路蛋白的磷酸化水平,另外也檢測了兩條信號通路上游蛋白ASK1及EGFR的磷酸化水平。 【結(jié)果】與高氧對照組相比,①小分子干擾Trx表達明顯增加了高氧暴露下A549細胞的ROS水平(P 0.05);②Trx表達抑制明顯增加了高氧誘導的細胞凋亡(P 0.05);③Trx表達抑制明顯增強了ASK1的活性,降低了EGFR的磷酸化程度(P 0.01);④Trx表達抑制激活了c-Jun N末端激酶1/2(c-Jun N-terminal protein kinase,JNK1/2)和P38絲裂原活化蛋白激酶(P38mitogen-activited protein kinase,p38)的活性(P 0.01),同時抑制了細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2 (extracellular signal regulated kinase,ERK1/2)和Akt活性(P 0.01)。 【結(jié)論】抑制Trx表達使高氧暴露下A549細胞凋亡數(shù)量增加;Trx通過MAPKs和PI3K/Akt信號通路調(diào)控高氧細胞損傷與凋亡是高氧暴露肺上皮細胞損傷的作用機制之一。 【目的】研究硫氧還蛋白( thioredoxin, Trx)過表達對高氧誘導的人肺腺癌A549細胞的影響,探討Trx在高氧細胞損傷中的保護作用。 【方法】體外傳代培養(yǎng)A549細胞,待其生長至融合狀態(tài)時將其分為四組,空氣對照組,空氣實驗組,高氧對照組和高氧實驗組。對照組轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒,實驗組轉(zhuǎn)染含Trx目的基因的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48h后,高氧兩組通以600mL.L-1中等濃度高氧;空氣兩組置于同一室空氣中;分別培養(yǎng)12h后收集細胞,采用流式細胞計數(shù)方法檢測各組A549細胞ROS生成和凋亡數(shù)量;用western blot檢測MAPKs信號通路中三個亞家族蛋白的磷酸化程度及PI3K/Akt信號通路蛋白的磷酸化水平;同時也檢測兩個上游蛋白的磷酸化水平。 【結(jié)果】與高氧對照組相比,①高氧實驗組細胞ROS產(chǎn)生和凋亡數(shù)量明顯減少(P 0.05);②Western blot顯示,Trx過表達明顯降低了ASK1的活性,增加了EGFR的磷酸化程度(P 0.01);③Western blot顯示,高氧實驗組ERK1/2和Akt磷酸化程度明顯增強(P 0.01),JNK和p-38磷酸化程度明顯減弱(P 0.05)。 【結(jié)論】Trx過表達可減少中等濃度的高氧誘導的肺泡上皮細胞凋亡保護上皮細胞免受高氧誘導的損傷,通過本研究我們進一步證明Trx能通過上調(diào)ERK1/2和Akt的活性程度,降低JNK1/2和p-38的磷酸化程度減少高氧誘導的A549細胞凋亡,從而在肺泡上皮細胞抵抗高氧損傷的作用機制中發(fā)揮作用。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2011
【中圖分類】：R722.6
【部分圖文】：

組織結(jié)構(gòu)明顯紊亂，肺泡形成顯著滯后，典型小直徑的肺泡數(shù)目較空氣組顯著減少，肺泡結(jié)構(gòu)簡單化和囊泡化。2.2 免疫組織化學法檢測肺組織 ASK1 動態(tài)表達及分布肺組織染色 ASK1 陽性信號為棕黃色顆粒，其廣泛表達于肺泡上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞等胞漿中，陰性對照無陽性染色。與空氣組比較，高氧暴露 1 d，ASK1 表達強度即顯著升高（P<0.05），4 d時達高峰，7 d后出現(xiàn)下降趨勢，但仍高于對照組（P<0.05）。見圖 1-1 和表 1-1。

圖 1-2 空氣組與高氧組不同時間點 Trx mRNA 表達情況 （M 為 Marker；1、3、5、7、9 和 2、4、6、8、10 分別代表空氣組和高氧組 1、4、7、10、14 d）。表1-2 兩組新生大鼠肺組織Trx mRNA表達的影響（ x±s）只數(shù) 1 d 4 d 7 d 10 d 14 d F 值 P 值 8 0.5641±0.0916 0.5695±0.0901 0.6577±0.0573 0.6860±0.0811a0.6223±0.0490 3.979 0.009 8 0.4402±0.0852 0.4697±0.0863 0.5036±0.0977 0.5125±0.0987 0.5177±0.0270 1.251 0.308 2.802 2.263 3.847 3.841 5.285 0.014 0.040 0.003 0.002 0.000注：與同組其他時間點比較aP＜0.052.4 高氧對肺組織TrxR mRNA表達的影響與空氣組相比，高氧暴露1 d TrxR mRNA表達即有增強，但兩組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；4 d后較空氣組明顯升高（P<0.01），7 d時達高峰；10 d后有

表1-2 兩組新生大鼠肺組織Trx mRNA表達的影響（ x±s）別 只數(shù) 1 d 4 d 7 d 10 d 14 d F 值 P 值氧組 8 0.5641±0.0916 0.5695±0.0901 0.6577±0.0573 0.6860±0.0811a0.6223±0.0490 3.979 0.009氣組 8 0.4402±0.0852 0.4697±0.0863 0.5036±0.0977 0.5125±0.0987 0.5177±0.0270 1.251 0.308值 2.802 2.263 3.847 3.841 5.285 值 0.014 0.040 0.003 0.002 0.000注：與同組其他時間點比較aP＜0.052.4 高氧對肺組織TrxR mRNA表達的影響與空氣組相比，高氧暴露1 d TrxR mRNA表達即有增強，但兩組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；4 d后較空氣組明顯升高（P<0.01），7 d時達高峰；10 d后有所降低，但仍高于對照組（P<0.05）。見圖1-3，表1-3。
【參考文獻】

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1 錢莉玲,常立文,張謙慎,容志惠;85%高濃度氧長期暴露誘發(fā)早產(chǎn)大鼠肺損傷(英文)[J];中國當代兒科雜志;2003年02期

2 常立文;早產(chǎn)兒慢性肺部疾病的防治進展[J];實用兒科臨床雜志;2004年02期

3 姜娜;常立文;盧紅艷;李文斌;彭瓊玲;蔡成;;高氧對早產(chǎn)大鼠肺組織細胞色素氧化酶亞基Ⅰ表達的影響[J];實用兒科臨床雜志;2006年24期

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本文編號：2838020