研究背景及目的:支氣管哮喘(以下簡(jiǎn)稱哮喘)是由多種炎癥細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞(如肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等)共同參與的氣道慢性炎癥性疾病。通常表現(xiàn)為廣泛的可逆性呼氣氣流受限,患者可出現(xiàn)反復(fù)發(fā)作的喘息、咳嗽、胸悶、氣急等癥狀,多在凌晨和夜間發(fā)作或加劇。支氣管哮喘如不及時(shí)治療或控制,會(huì)出現(xiàn)氣道重塑等不可逆的病理改變,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。近幾十年來(lái),哮喘在全球范圍內(nèi)的患病率成逐年上升的趨勢(shì)。在世界范圍內(nèi),哮喘患者已經(jīng)超過(guò)3億,而我國(guó)則超過(guò)了 3000萬(wàn)。哮喘給患者和社會(huì)帶來(lái)了巨大的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),因此對(duì)哮喘發(fā)病原因和機(jī)制的研究至關(guān)重要。哮喘的發(fā)生是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。它是一種有明顯家族聚集傾向的多基因遺傳性疾病。同時(shí),哮喘的發(fā)生發(fā)展還與環(huán)境因素密切相關(guān)。我們所接觸的外部環(huán)境,如過(guò)敏原、大氣污染物、氣象因素、病原微生物等都認(rèn)為與哮喘有著密切的聯(lián)系。除了外部環(huán)境,機(jī)體內(nèi)部的微生態(tài)環(huán)境也對(duì)哮喘的發(fā)生發(fā)展起到了至關(guān)重要的作用。外部及內(nèi)部環(huán)境的共同作用會(huì)對(duì)幼年時(shí)期的機(jī)體免疫系統(tǒng)成熟發(fā)展的過(guò)程產(chǎn)生影響,從而導(dǎo)致兒童哮喘的發(fā)生。機(jī)體的內(nèi)環(huán)境主要由共生在體內(nèi)的微生物群落所組成,除了所熟知的胃腸道,皮膚、呼吸道、泌尿道等各系統(tǒng)也都有其特定的微生物定植,組成了機(jī)體獨(dú)特的微生態(tài)系統(tǒng)。當(dāng)微生態(tài)系統(tǒng)受到一些因素的影響而失衡時(shí),會(huì)引起一些疾病(如炎癥性腸病、特異性皮炎、代謝性疾病、心血管疾病等)的發(fā)生。研究表明,生命早期是機(jī)體微生態(tài)系統(tǒng)從無(wú)到有、發(fā)展成熟的重要時(shí)期,在這一階段某些外在因素的干擾會(huì)導(dǎo)致微生態(tài)系統(tǒng)的失衡,從而對(duì)機(jī)體的健康產(chǎn)生影響。近年來(lái),隨著醫(yī)療水平和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,生活方式、飲食習(xí)慣、醫(yī)療干預(yù)等都會(huì)影響體內(nèi)微生態(tài)系統(tǒng)的組成。其中抗生素的使用在兒童中越來(lái)越普遍,雖然它能夠有效的殺滅病原菌,但同時(shí)也會(huì)破壞機(jī)體內(nèi)部的微生態(tài)系統(tǒng),造成暫時(shí)或持續(xù)的微生態(tài)系統(tǒng)的失衡,引起免疫紊亂,從而影響免疫相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展。人體每日所接觸到的外部環(huán)境也與哮喘的發(fā)生有著密切的關(guān)系。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,大氣污染的形勢(shì)日益嚴(yán)峻。大氣細(xì)顆粒物(PM2.5)是大氣污染物中的重要組成成分,它特殊的理化性質(zhì)使得其能隨著空氣直接深入到細(xì)支氣管和肺泡,干擾肺部的氣體交換,引起一系列呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生。同時(shí),全球變暖大陸氣溫升高,導(dǎo)致一系列伴隨效應(yīng)的發(fā)生。極端天氣的出現(xiàn)會(huì)對(duì)哮喘患者的病情產(chǎn)生影響。因此,探究氣象因素與哮喘的發(fā)生與發(fā)展之間的關(guān)系顯得十分迫切。由此,我們擬通過(guò)探討內(nèi)外環(huán)境與哮喘發(fā)生發(fā)展之間的聯(lián)系來(lái)討論影響哮喘發(fā)生發(fā)展的因素。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分別從臨床和動(dòng)物模型兩方面研究?jī)?nèi)環(huán)境和外環(huán)境對(duì)哮喘發(fā)生發(fā)展的影響,試圖為今后哮喘的早期防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新的思路。研究對(duì)象與方法:(1)對(duì)哮喘患兒及健康兒童進(jìn)行回顧性的問(wèn)卷調(diào)查,具體內(nèi)容包括:基本情況、哮喘發(fā)病情況、個(gè)人及家族過(guò)敏史、出生喂養(yǎng)史、抗生素使用情況、香煙暴露情況等。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,尋找在遺傳背景、生活方式、抗生素的使用情況等方面與哮喘發(fā)生可能相關(guān)的危險(xiǎn)因素。(2)在生命早期使用萬(wàn)古霉素干預(yù)C57BL/6小鼠,并在小鼠6周齡時(shí)停用萬(wàn)古霉素后予以建立OVA誘導(dǎo)的哮喘模型。模型建立成功后檢測(cè)肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)及分類細(xì)胞計(jì)數(shù)的情況,并通過(guò)病理切片染色觀察氣道周圍炎癥浸潤(rùn)及氣道內(nèi)粘液分泌情況,利用Q-PCR方法檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá),觀察萬(wàn)古霉素的干預(yù)對(duì)后續(xù)哮喘的氣道炎癥所產(chǎn)生的影響。同時(shí)使用16S rDNA測(cè)序的方法對(duì)腸道和氣道微生態(tài)系統(tǒng)的組成進(jìn)行分析,探討萬(wàn)古霉素暴露后機(jī)體微生態(tài)系統(tǒng)的變化情況。(3)收集2014年-2017年氣象因素(溫度、PM2.5、PM10)的月均數(shù)據(jù),并統(tǒng)計(jì)相應(yīng)月份浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院哮喘兒童的就診情況及全院門急診量。對(duì)氣象因素與哮喘患兒就診情況進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,尋找氣象條件與哮喘發(fā)病的相關(guān)性。(4)分別利用不同溫度條件(10℃、20℃、30℃)對(duì)小鼠哮喘模型進(jìn)行干預(yù)。建立HDM誘導(dǎo)的哮喘模型,并進(jìn)行PM2.5的短期暴露。通過(guò)對(duì)哮喘動(dòng)物模型的處理,檢測(cè)肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)的情況,觀察氣道周圍炎癥浸潤(rùn)及氣道內(nèi)粘液分泌情況,及檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá),分別觀察不同溫度條件及PM2.5對(duì)哮喘氣道炎癥所產(chǎn)生的影響。結(jié)果:(1)通過(guò)回顧性調(diào)查問(wèn)卷分析,發(fā)現(xiàn)兒童哮喘以冬季最為多發(fā),發(fā)作誘因以呼吸道感染最為常見。哮喘兒童中相關(guān)過(guò)敏性疾病的發(fā)生比健康兒童顯著增加,其中哮喘患兒合并過(guò)敏性鼻炎的比例最高。哮喘兒童中過(guò)敏性家族史及過(guò)敏原檢測(cè)陽(yáng)性率高于健康對(duì)照組兒童,塵螨為哮喘兒童最為常見的過(guò)敏原。抗生素在哮喘兒童中首次暴露的時(shí)間比健康兒童提前,1歲內(nèi)和3歲內(nèi)抗生素使用的次數(shù)也較健康兒童多。同時(shí),哮喘兒童中3歲內(nèi)抗生素使用的最長(zhǎng)療程明顯長(zhǎng)于對(duì)照組兒童。經(jīng)過(guò)Logistic回歸分析,發(fā)現(xiàn)過(guò)敏原檢測(cè)陽(yáng)性、過(guò)敏家族史、3歲內(nèi)使用抗生素次數(shù)這三項(xiàng)為兒童哮喘發(fā)病的危險(xiǎn)因素。(2)在小鼠的哮喘模型中,我們發(fā)現(xiàn)生命早期萬(wàn)古霉素的干預(yù)會(huì)加重后續(xù)哮喘發(fā)生的氣道炎癥反應(yīng)。同時(shí),萬(wàn)古霉素的暴露會(huì)引起腸道及氣道微生態(tài)的失衡,其中腸道內(nèi)厚壁菌的減少及氣道內(nèi)Clostridiaceae-1和Micrococcaceae的減少可能與Th2免疫反應(yīng)的上調(diào)及哮喘氣道炎癥的加重有關(guān)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),生命早期短時(shí)間的萬(wàn)古霉素暴露并不會(huì)導(dǎo)致哮喘氣道炎癥的加重。(3)對(duì)氣象因素(溫度、PM2.5、PM10)與哮喘就診情況進(jìn)行相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn),月均溫度與哮喘兒童的就診量及哮喘就診比例呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān),并且這一現(xiàn)象在小于6歲的兒童中表現(xiàn)得比較明顯。月均PM2.5的濃度與哮喘兒童急診就診人次存在較為明顯的正相關(guān),在小于6歲的兒童中,PM2.5還與哮喘就診比例有著明顯的相關(guān)性。月均PM10的濃度變化與哮喘急診人次和哮喘就診比例存在中等程度的正相關(guān)性,并且這一相關(guān)性在小于6歲兒童中更為明顯。(4)哮喘模型小鼠在10℃、20℃、30℃這三種不同環(huán)境溫度的干預(yù)下,其氣道中的炎癥細(xì)胞及粘液分泌情況和相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)并無(wú)明顯差異。對(duì)HDM誘導(dǎo)的哮喘模型進(jìn)行PM2.5的短期暴露會(huì)增加肺泡灌洗液中的炎癥細(xì)胞數(shù)量,引起氣道周圍炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和氣道內(nèi)粘液分泌的增加,同時(shí)肺組織內(nèi)GM-CSF和IL-33及Th2相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)增加。結(jié)論:(1)過(guò)敏原檢測(cè)陽(yáng)性、過(guò)敏家族史、3歲內(nèi)使用抗生素次數(shù)是兒童哮喘發(fā)生的危險(xiǎn)因素。(2)生命早期萬(wàn)古霉素的使用可能通過(guò)改變腸道和氣道微生態(tài)、上調(diào)Th2免疫反應(yīng)導(dǎo)致后續(xù)哮喘模型的氣道炎癥反應(yīng)的加重。(3)月均環(huán)境溫度、PM2.5及PM10的濃度可能與哮喘發(fā)病有關(guān),小于6歲的兒童尤為明顯。(4)不同的溫度條件不會(huì)引起哮喘小鼠氣道炎癥的改變。PM2.5的短期暴露會(huì)引起肺組織內(nèi)GM-CSF和IL-33的表達(dá)增加,增加Th2相關(guān)細(xì)胞因子的分泌,加重HDM誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型的氣道炎癥反應(yīng)。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R725.6
【部分圖文】：

浙江大學(xué)博士學(xué)位論文?正文第一部分（二）材料和方法??配現(xiàn)用。??（７）?７５％乙醇：�。梗梗梗o(wú)水乙醇，按３：?１比例加入適量ｄｄＨ２０，充分?jǐn)嚢??混勻，即配置成７５％乙醇。??（８）萬(wàn)古霉素溶液：稱�。玻埃埃恚烊f(wàn)古霉素溶于１０００ｍｌ?ｄｄＨ２０中，配置成??２００ｍｌ／Ｌ濃度溶液。??２．２．５實(shí)驗(yàn)方法：??２．２．５．１主要實(shí)驗(yàn)流程圖：??ＢＡＬＦ總細(xì)胞及分類細(xì)胞計(jì)數(shù)??

２．２．５．３哮喘模型的構(gòu)建??（１）致敏：在模型建立的第０天和第１４天，哮喘組（ＯＶＡ組）和萬(wàn)古霉素??哮喘組（ＶＡＮ－ＯＶＡ組）小鼠腹腔注射致敏液０．２ｍｌ?（８０陴）／只小鼠，??生理鹽水對(duì)照組及萬(wàn)古霉素對(duì)照組小鼠腹腔注射生理鹽水０．２ｍｌ。??（２）激發(fā)：在模型建立第２４、２５、２６天，哮喘組（ＯＶＡ組）和萬(wàn)古霉素哮??喘組（ＶＡＮ－ＯＶＡ組）小鼠被放置至密閉容器中通過(guò)超聲霧化裝置吸入??１．５％０ＶＡ霧化激發(fā)液８ｍｌ，霧化時(shí)間為４０ｍｉｎ／次／天。生理鹽水對(duì)照組??和萬(wàn)古霉素對(duì)照組小鼠用生理鹽水８ｍｌ替代霧化激發(fā)液，同一方法霧化??４０ｍｉｎ。??３２??

萬(wàn)古霉素對(duì)照組（ＶＡＮ－ＮＳ）的小鼠肺組織切片中氣道周圍幾乎看不到炎癥細(xì)胞的??浸潤(rùn)。而哮喘組（ＯＶＡ）以及萬(wàn)古霉素哮喘組（ＶＡＮ－ＯＶＡ）小鼠的氣道周圍存在??著不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖２．４?Ａ），符合ＯＶＡ誘導(dǎo)的哮喘模型病理切片Ｈ＆Ｅ??染色的表現(xiàn)。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步評(píng)分統(tǒng)計(jì)后，我們發(fā)現(xiàn)與哮喘組相比（ＯＶＡ），萬(wàn)古霉素??干預(yù)后哮喘小鼠的氣道周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的數(shù)目和層數(shù)明顯增加，兩組間比較存??在顯著性差異（Ｐ＜０．０００１）（圖２．４Ｂ）。??４４??
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