研究背景及目的:支氣管哮喘(以下簡稱哮喘)是由多種炎癥細胞和結(jié)構(gòu)細胞(如肥大細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、氣道上皮細胞、平滑肌細胞等)共同參與的氣道慢性炎癥性疾病。通常表現(xiàn)為廣泛的可逆性呼氣氣流受限,患者可出現(xiàn)反復發(fā)作的喘息、咳嗽、胸悶、氣急等癥狀,多在凌晨和夜間發(fā)作或加劇。支氣管哮喘如不及時治療或控制,會出現(xiàn)氣道重塑等不可逆的病理改變,嚴重影響患者的生活質(zhì)量。近幾十年來,哮喘在全球范圍內(nèi)的患病率成逐年上升的趨勢。在世界范圍內(nèi),哮喘患者已經(jīng)超過3億,而我國則超過了 3000萬。哮喘給患者和社會帶來了巨大的心理和經(jīng)濟負擔,因此對哮喘發(fā)病原因和機制的研究至關(guān)重要。哮喘的發(fā)生是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。它是一種有明顯家族聚集傾向的多基因遺傳性疾病。同時,哮喘的發(fā)生發(fā)展還與環(huán)境因素密切相關(guān)。我們所接觸的外部環(huán)境,如過敏原、大氣污染物、氣象因素、病原微生物等都認為與哮喘有著密切的聯(lián)系。除了外部環(huán)境,機體內(nèi)部的微生態(tài)環(huán)境也對哮喘的發(fā)生發(fā)展起到了至關(guān)重要的作用。外部及內(nèi)部環(huán)境的共同作用會對幼年時期的機體免疫系統(tǒng)成熟發(fā)展的過程產(chǎn)生影響,從而導致兒童哮喘的發(fā)生。機體的內(nèi)環(huán)境主要由共生在體內(nèi)的微生物群落所組成,除了所熟知的胃腸道,皮膚、呼吸道、泌尿道等各系統(tǒng)也都有其特定的微生物定植,組成了機體獨特的微生態(tài)系統(tǒng)。當微生態(tài)系統(tǒng)受到一些因素的影響而失衡時,會引起一些疾病(如炎癥性腸病、特異性皮炎、代謝性疾病、心血管疾病等)的發(fā)生。研究表明,生命早期是機體微生態(tài)系統(tǒng)從無到有、發(fā)展成熟的重要時期,在這一階段某些外在因素的干擾會導致微生態(tài)系統(tǒng)的失衡,從而對機體的健康產(chǎn)生影響。近年來,隨著醫(yī)療水平和經(jīng)濟的發(fā)展,生活方式、飲食習慣、醫(yī)療干預等都會影響體內(nèi)微生態(tài)系統(tǒng)的組成。其中抗生素的使用在兒童中越來越普遍,雖然它能夠有效的殺滅病原菌,但同時也會破壞機體內(nèi)部的微生態(tài)系統(tǒng),造成暫時或持續(xù)的微生態(tài)系統(tǒng)的失衡,引起免疫紊亂,從而影響免疫相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展。人體每日所接觸到的外部環(huán)境也與哮喘的發(fā)生有著密切的關(guān)系。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展,大氣污染的形勢日益嚴峻。大氣細顆粒物(PM2.5)是大氣污染物中的重要組成成分,它特殊的理化性質(zhì)使得其能隨著空氣直接深入到細支氣管和肺泡,干擾肺部的氣體交換,引起一系列呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生。同時,全球變暖大陸氣溫升高,導致一系列伴隨效應的發(fā)生。極端天氣的出現(xiàn)會對哮喘患者的病情產(chǎn)生影響。因此,探究氣象因素與哮喘的發(fā)生與發(fā)展之間的關(guān)系顯得十分迫切。由此,我們擬通過探討內(nèi)外環(huán)境與哮喘發(fā)生發(fā)展之間的聯(lián)系來討論影響哮喘發(fā)生發(fā)展的因素。在實驗過程中分別從臨床和動物模型兩方面研究內(nèi)環(huán)境和外環(huán)境對哮喘發(fā)生發(fā)展的影響,試圖為今后哮喘的早期防治提供實驗依據(jù)和新的思路。研究對象與方法:(1)對哮喘患兒及健康兒童進行回顧性的問卷調(diào)查,具體內(nèi)容包括:基本情況、哮喘發(fā)病情況、個人及家族過敏史、出生喂養(yǎng)史、抗生素使用情況、香煙暴露情況等。利用統(tǒng)計學方法,尋找在遺傳背景、生活方式、抗生素的使用情況等方面與哮喘發(fā)生可能相關(guān)的危險因素。(2)在生命早期使用萬古霉素干預C57BL/6小鼠,并在小鼠6周齡時停用萬古霉素后予以建立OVA誘導的哮喘模型。模型建立成功后檢測肺泡灌洗液中細胞總數(shù)及分類細胞計數(shù)的情況,并通過病理切片染色觀察氣道周圍炎癥浸潤及氣道內(nèi)粘液分泌情況,利用Q-PCR方法檢測相關(guān)細胞因子的表達,觀察萬古霉素的干預對后續(xù)哮喘的氣道炎癥所產(chǎn)生的影響。同時使用16S rDNA測序的方法對腸道和氣道微生態(tài)系統(tǒng)的組成進行分析,探討萬古霉素暴露后機體微生態(tài)系統(tǒng)的變化情況。(3)收集2014年-2017年氣象因素(溫度、PM2.5、PM10)的月均數(shù)據(jù),并統(tǒng)計相應月份浙江大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院哮喘兒童的就診情況及全院門急診量。對氣象因素與哮喘患兒就診情況進行關(guān)聯(lián)分析,尋找氣象條件與哮喘發(fā)病的相關(guān)性。(4)分別利用不同溫度條件(10℃、20℃、30℃)對小鼠哮喘模型進行干預。建立HDM誘導的哮喘模型,并進行PM2.5的短期暴露。通過對哮喘動物模型的處理,檢測肺泡灌洗液中細胞總數(shù)及分類計數(shù)的情況,觀察氣道周圍炎癥浸潤及氣道內(nèi)粘液分泌情況,及檢測相關(guān)細胞因子的表達,分別觀察不同溫度條件及PM2.5對哮喘氣道炎癥所產(chǎn)生的影響。結(jié)果:(1)通過回顧性調(diào)查問卷分析,發(fā)現(xiàn)兒童哮喘以冬季最為多發(fā),發(fā)作誘因以呼吸道感染最為常見。哮喘兒童中相關(guān)過敏性疾病的發(fā)生比健康兒童顯著增加,其中哮喘患兒合并過敏性鼻炎的比例最高。哮喘兒童中過敏性家族史及過敏原檢測陽性率高于健康對照組兒童,塵螨為哮喘兒童最為常見的過敏原�？股卦谙瓋和惺状伪┞兜臅r間比健康兒童提前,1歲內(nèi)和3歲內(nèi)抗生素使用的次數(shù)也較健康兒童多。同時,哮喘兒童中3歲內(nèi)抗生素使用的最長療程明顯長于對照組兒童。經(jīng)過Logistic回歸分析,發(fā)現(xiàn)過敏原檢測陽性、過敏家族史、3歲內(nèi)使用抗生素次數(shù)這三項為兒童哮喘發(fā)病的危險因素。(2)在小鼠的哮喘模型中,我們發(fā)現(xiàn)生命早期萬古霉素的干預會加重后續(xù)哮喘發(fā)生的氣道炎癥反應。同時,萬古霉素的暴露會引起腸道及氣道微生態(tài)的失衡,其中腸道內(nèi)厚壁菌的減少及氣道內(nèi)Clostridiaceae-1和Micrococcaceae的減少可能與Th2免疫反應的上調(diào)及哮喘氣道炎癥的加重有關(guān)。進一步實驗研究發(fā)現(xiàn),生命早期短時間的萬古霉素暴露并不會導致哮喘氣道炎癥的加重。(3)對氣象因素(溫度、PM2.5、PM10)與哮喘就診情況進行相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn),月均溫度與哮喘兒童的就診量及哮喘就診比例呈現(xiàn)明顯的負相關(guān),并且這一現(xiàn)象在小于6歲的兒童中表現(xiàn)得比較明顯。月均PM2.5的濃度與哮喘兒童急診就診人次存在較為明顯的正相關(guān),在小于6歲的兒童中,PM2.5還與哮喘就診比例有著明顯的相關(guān)性。月均PM10的濃度變化與哮喘急診人次和哮喘就診比例存在中等程度的正相關(guān)性,并且這一相關(guān)性在小于6歲兒童中更為明顯。(4)哮喘模型小鼠在10℃、20℃、30℃這三種不同環(huán)境溫度的干預下,其氣道中的炎癥細胞及粘液分泌情況和相關(guān)細胞因子的表達并無明顯差異。對HDM誘導的哮喘模型進行PM2.5的短期暴露會增加肺泡灌洗液中的炎癥細胞數(shù)量,引起氣道周圍炎癥細胞的浸潤和氣道內(nèi)粘液分泌的增加,同時肺組織內(nèi)GM-CSF和IL-33及Th2相關(guān)細胞因子的表達增加。結(jié)論:(1)過敏原檢測陽性、過敏家族史、3歲內(nèi)使用抗生素次數(shù)是兒童哮喘發(fā)生的危險因素。(2)生命早期萬古霉素的使用可能通過改變腸道和氣道微生態(tài)、上調(diào)Th2免疫反應導致后續(xù)哮喘模型的氣道炎癥反應的加重。(3)月均環(huán)境溫度、PM2.5及PM10的濃度可能與哮喘發(fā)病有關(guān),小于6歲的兒童尤為明顯。(4)不同的溫度條件不會引起哮喘小鼠氣道炎癥的改變。PM2.5的短期暴露會引起肺組織內(nèi)GM-CSF和IL-33的表達增加,增加Th2相關(guān)細胞因子的分泌,加重HDM誘導的小鼠哮喘模型的氣道炎癥反應。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R725.6
【部分圖文】：

浙江大學博士學位論文?正文第一部分（二）材料和方法??配現(xiàn)用。??（７）?７５％乙醇：�。梗梗梗o水乙醇，按３：?１比例加入適量ｄｄＨ２０，充分攪拌??混勻，即配置成７５％乙醇。??（８）萬古霉素溶液：稱�。玻埃埃恚烊f古霉素溶于１０００ｍｌ?ｄｄＨ２０中，配置成??２００ｍｌ／Ｌ濃度溶液。??２．２．５實驗方法：??２．２．５．１主要實驗流程圖：??ＢＡＬＦ總細胞及分類細胞計數(shù)??

２．２．５．３哮喘模型的構(gòu)建??（１）致敏：在模型建立的第０天和第１４天，哮喘組（ＯＶＡ組）和萬古霉素??哮喘組（ＶＡＮ－ＯＶＡ組）小鼠腹腔注射致敏液０．２ｍｌ?（８０陴）／只小鼠，??生理鹽水對照組及萬古霉素對照組小鼠腹腔注射生理鹽水０．２ｍｌ。??（２）激發(fā)：在模型建立第２４、２５、２６天，哮喘組（ＯＶＡ組）和萬古霉素哮??喘組（ＶＡＮ－ＯＶＡ組）小鼠被放置至密閉容器中通過超聲霧化裝置吸入??１．５％０ＶＡ霧化激發(fā)液８ｍｌ，霧化時間為４０ｍｉｎ／次／天。生理鹽水對照組??和萬古霉素對照組小鼠用生理鹽水８ｍｌ替代霧化激發(fā)液，同一方法霧化??４０ｍｉｎ。??３２??

萬古霉素對照組（ＶＡＮ－ＮＳ）的小鼠肺組織切片中氣道周圍幾乎看不到炎癥細胞的??浸潤。而哮喘組（ＯＶＡ）以及萬古霉素哮喘組（ＶＡＮ－ＯＶＡ）小鼠的氣道周圍存在??著不同程度的炎癥細胞浸潤（圖２．４?Ａ），符合ＯＶＡ誘導的哮喘模型病理切片Ｈ＆Ｅ??染色的表現(xiàn)。經(jīng)過進一步評分統(tǒng)計后，我們發(fā)現(xiàn)與哮喘組相比（ＯＶＡ），萬古霉素??干預后哮喘小鼠的氣道周圍炎癥細胞浸潤的數(shù)目和層數(shù)明顯增加，兩組間比較存??在顯著性差異（Ｐ＜０．０００１）（圖２．４Ｂ）。??４４??
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本文編號：2835159