目的：利用體外生物誘導方法研究BMSCs的神經(jīng)分化能力,免疫熒光技術(shù)檢測Nestin表達；利用transwell體外遷移模型觀察BMSCs向缺氧缺血性腦組織的遷移能力。 方法：參照Rice等和國內(nèi)吳婉芳等的方法,制作HIBD模型。造模24h后,將大鼠斷頭處死,剪開顱骨,觀察雙側(cè)大腦半球的大體形態(tài),然后在冰板上迅速分離患側(cè)大腦半球并立即置于液氮中,之后凍存于-80℃冰箱中備用。取出腦組織,稱重,用0.9%預冷到4℃的生理鹽水按1：9制備成10%的腦組織勻漿,4℃×3000g×10min離心,留上清。 2周齡SD大鼠4-6只,頸部脫臼處死,無菌條件下取出雙側(cè)股骨,剪開兩側(cè)干骺端,沖洗骨髓腔,制成單細胞懸液,移入25ml塑料培養(yǎng)瓶中,37℃,5%CO2飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),三天后首次換液,去除未貼壁細胞,以后每三天換液一次,倒置相差顯微鏡下觀察細胞達到80%-90%融合時,用0.25%胰蛋白酶消化,按1：3比例傳代培養(yǎng)。 待第四代細胞達到90%融合時,取約1×106個細胞懸于100μlPBS中,分別加入適量FITC標記CD29、CD31、CD44、CD45、CD90抗體避光染色30分鐘。后用1%多聚甲醛600μl重懸,流式細胞儀進行檢測。 選用3-5代的BMSCs進行誘導分化,以5×104／ml密度接種于事先放置涂有多聚賴氨酸蓋玻片的六孔板內(nèi)制備細胞爬片。細胞達80%融合時,將造模24h后HIBD鼠及8日齡正常鼠左腦上清液、右腦上清液與BMSCs共培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細胞變化。共培養(yǎng)24h后,正常腦組織誘導組、HIBD誘導組、未誘導組蓋玻片取出,4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗滌,1%Triton-X-100破膜,PBS洗滌,正常山羊血清室溫封閉15 min,加入Nestin抗體(1：100),濕盒4℃冰箱過夜。從冰箱拿出后,室溫復溫40 min,PBS漂洗3次,加入二抗,山羊抗兔IgG-FITC (1:100)避光孵育30 min,PBS漂洗3次,Depy復染核,甘油封片,陰性對照用PBS取代一抗。熒光顯微鏡下計算陽性率。 在Transwell上室的聚加入DMEM稀釋后Matrigel,合成凝膠碳酸酯膜上。按5×104/cm2密度,配成細胞懸液,接種于上室,只加DMEM,不加FBS,每孔100μl。HIBD組、正常腦組織組、DMEM+FBS組、單純DMEM組每組10孔,下室中加入各種條件培養(yǎng)基500μl, HIBD組中條件培養(yǎng)基為HIBD腦組織上清液100μl,加入DMEM培養(yǎng)液中配成的含F(xiàn)BS15%培養(yǎng)基；正常腦組織組中由正常腦組織上清液代替HIBD,腦組織上清液；DMEM+FBS組的條件培養(yǎng)基為含15%FBS的DMEM;單純DMEM組只加DMEM,不加FBS。后置于37℃培養(yǎng)箱中,孵育24h；取出transwell用PBS洗2遍,5%戊二醛固定,4℃；加入蘇木素染色,用棉球擦去上表面細胞,顯微鏡下觀察。 結(jié)果：細胞接種于培養(yǎng)瓶中后4-6h開始貼壁,10-14d后細胞貼壁細胞達到80-90%融合,1：2比例進行傳代,至第三代細胞為成纖維細胞樣細胞,胞體細長呈纖維狀,細胞核較大,形態(tài)為均一的紡錘形。經(jīng)流式細胞儀檢測,大鼠BMSCs表面CD29(99.83%)、CD44(99.77%)、CD90(99.86%)陽性,CD31(0.83%)、CD34(1.78%)、CD45(2.90%)陰性。 BMSCs與腦組織上清液共培養(yǎng)24h后細胞形態(tài)逐漸發(fā)生變化：原來寬大扁平的長梭形細胞胞體回縮,變圓,后逐漸伸出突起,突起逐漸增多,有些逐漸伸長,類似神經(jīng)細胞形態(tài)。各組細胞進行Nestin免疫熒光染色表明,細胞誘導24h后免疫細胞熒光檢HIBD誘導組、正常腦組織誘導組細胞均有Nestin表達,陽性率分別為(31.76±3.56)%、(19.46±2.61)%,未誘導組Nestin陽性率為(2.57±0.73)%,陰性對照組未檢測到熒光。HIBD腦組織上清液誘導后細胞表達Nestin陽性率高于正常腦組織上清液誘導組(P0.01)。 鏡下可見不同比例BMSCs向下室遷移情況。單純DMEM組細胞遷移率(2.69±0.74)%,DMEM+FBS組為(14.91±1.54)%,正常腦組織組為(20.18±4.86)%,HIBD組為(39.42±2.81)%,其中腦損傷24h組向下室遷移細胞最多,與其他各組比較均有統(tǒng)計學意義(P0.01)。左右腦相比無統(tǒng)計學差異。 結(jié)論：大鼠BMSCs可通過直接貼壁法進行體外培養(yǎng),獲得細胞純度較高,細胞大多呈有序的漩渦狀排列。培養(yǎng)過程中偶爾會出現(xiàn)早衰細胞,原因有待進一步探討。經(jīng)HIBD腦組織上清液誘導后,BMSCs出現(xiàn)類似神經(jīng)細胞形態(tài),并表達神經(jīng)前體細胞的標志蛋白之一Nestin。HIBD腦組織上清液誘導組BMSCs的Nestin陽性率高于正常腦組織誘導組。BMSCs具有向缺氧缺血性腦組織定向遷移的能力,且向HIBD腦組織遷移能力高于正常腦組織(P0.01)。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2010
【中圖分類】：R722.1
【部分圖文】：

%、(19.46士2.61)%，未誘導組Nestin陽性率為(2.57士0.73)%，陰性對照組未檢測到熒光。HIBD腦組織上清液誘導后細胞表達Nestin陽性率高于正常腦組織上清液誘導組(P<0.01)(見圖3.3)。

圖 4.2Transwezl小室模式圖4.2結(jié)果棉簽拭去上表面貼附細胞后鏡況，見圖4。單純DMEM組僅見個別細胞遷移 組為(14.91士1.54)%，正常腦組織組為士2.81)%，其中腦損傷24h組向下室遷移學意義(尸<0.01)。左右腦相比無統(tǒng)計學

T口nSWe川nsertUP陣rcom陽rtmen*Micro閃rousmemb舊ne匕柑ercom陽rtment圖4.2Transwezl小室模式圖4.2結(jié)果棉簽拭去上表面貼附細胞后鏡下可見不同比例BMSCS向下室遷移情況，見圖4。單純DMEM組僅見個別細胞遷移至下室為(2.69士0.74)%，DMEM+FBS組為(14.91士1.54)%，正常腦組織組為(20.18士4.86)%，HIBD組為(39.42士2.81)%，其中腦損傷24h組向下室遷移細胞最多，與其他各組比較均有統(tǒng)計學意義(尸<0.01)。左右腦相比無統(tǒng)計學差異。
【參考文獻】

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本文編號：2835117