背景:新生兒窒息可以發(fā)生在產(chǎn)前,產(chǎn)時(shí)或者產(chǎn)后期。我國(guó)現(xiàn)在每年出生約2000萬(wàn)新生兒,窒息發(fā)生率占活產(chǎn)新生兒的5%-10%,新生兒窒息是當(dāng)前我國(guó)新生兒死亡的第一位死因,也是致殘的重要原因。窒息后多臟器血流動(dòng)力學(xué)變化和各臟器間的血流再分配可導(dǎo)致多器官功能損傷,即缺血再灌注損傷。相關(guān)研究表明窒息后的多器官功能損傷中腎損傷的發(fā)生率最高,而腎小管作為腎單位的主要結(jié)構(gòu)之一,其損傷發(fā)生最早,進(jìn)一步證明損傷最早、最敏感的靶細(xì)胞是腎近曲小管上皮細(xì)胞�！� 我們的前期研究發(fā)現(xiàn),新生兒窒息后腎損傷組外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于非損傷組,且與腎功能損傷程度呈正相關(guān);在窒息大鼠恢復(fù)供氧的模型中進(jìn)一步觀察到腎組織白細(xì)胞滯留數(shù)明顯增多。說(shuō)明一些炎癥細(xì)胞因子(IL-8,TNF-α等)及大量氧自由基的產(chǎn)生對(duì)窒息的發(fā)病及腎損傷的發(fā)生起重要作用。我們還觀察到用新生兒窒息后血清來(lái)處理培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞其凋亡率增加,證明凋亡是窒息后腎損傷的一種形式。但是,窒息后血清誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制仍不清楚。 線粒體作為真核細(xì)胞內(nèi)能量生成的場(chǎng)所,是窒息后細(xì)胞損傷最敏感的細(xì)胞器。而且在細(xì)胞凋亡內(nèi)外多條信號(hào)通路中,線粒體通過(guò)釋放各種凋亡蛋白形成調(diào)控細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)。那么,在窒息后血清誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡中是否有線粒體途徑的激活呢? 核因子-κB(NF-κB)作為調(diào)節(jié)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子之一,是炎癥反應(yīng)的觸發(fā)器及關(guān)鍵環(huán)節(jié)。已證實(shí)NF-κB是調(diào)節(jié)編碼多種前炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子和粘附分子基因的重要轉(zhuǎn)錄因子。目前研究證實(shí)窒息后血清誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡的機(jī)制牽涉到NF-KB的活化�；罨蟮暮艘蜃� κB是否參與線粒體途徑的激活呢? 因此,本研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,探討新生兒窒息后血清對(duì)HK-2細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位變化,相關(guān)凋亡蛋白釋放以及促凋亡蛋白表達(dá)的影響及其與NF-κB活化的關(guān)系,旨在闡明窒息后腎小管損傷的機(jī)制。 目的:研究新生兒窒息后血清誘導(dǎo)人近曲腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)凋亡的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。 方法:(1)以人近曲腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)為研究對(duì)象,用含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)。(2)新生兒窒息后血清的制備:選擇2006年9月～2007年6月在我科住院的未使用免疫抑制劑、無(wú)明顯感染性疾病的足月重度室息新生兒。在窒息后24h抽取外周血5 mL(肝素抗凝),離心并分離出血清,滅活補(bǔ)體后-20℃保存?zhèn)溆谩?3)窒息后血清誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷模型的建立:采用上述方法處理的窒息后血清,用DMEM/F12培養(yǎng)液配成20%(體積比,v/v)的攻擊濃度,攻擊正常培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞。(4)實(shí)驗(yàn)分組:共分為三組,即正常對(duì)照組、窒息組和吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)干預(yù)組。PDTC是NF-κB的特異性抑制劑,根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們應(yīng)用的終濃度為40μM。即在實(shí)驗(yàn)前24h將培養(yǎng)液換成含20%窒息血清的DMEM培養(yǎng)液的同時(shí)加入40μM PDTC。(5)檢測(cè)指標(biāo):倒置相差顯微鏡下觀察HK-2細(xì)胞生長(zhǎng)情況;激光共聚焦顯微鏡測(cè)HK-2細(xì)胞線粒體膜電位(MMP)變化;免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)HK-2細(xì)胞胞漿內(nèi)促凋亡蛋白Bad、Bax的表達(dá)情況;Western blot測(cè)HK-2細(xì)胞內(nèi)線粒體中CytC,AIF的釋放情況。(6)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用one-way ANOVA分析,組間比較用LSD法。數(shù)據(jù)均用x±s表示,采用SPSS10.0軟件處理。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果:(1)倒置相差顯微鏡下觀察到對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),呈類(lèi)上皮樣扁平多角形,折光性強(qiáng),細(xì)胞間連接緊密,分裂像多,數(shù)量多。窒息組細(xì)胞生長(zhǎng)減慢,貼壁性差,細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯減少,形態(tài)變?yōu)椴灰?guī)則圓形或橢圓形,折光性減弱,胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡,脂滴,顆粒樣物,細(xì)胞間連接松散,并可見(jiàn)較多細(xì)胞碎片。PDTC干預(yù)組較對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量變化不大,形態(tài)變化小,部分細(xì)胞有收縮變圓,細(xì)胞折光性較強(qiáng)。(2)與正常對(duì)照組(2.96±0.38)相比,窒息組(0.87±0.06)和PDTC干預(yù)組(2.46±0.52)細(xì)胞線粒體膜紅/綠熒光強(qiáng)度比值(590/530nm)明顯降低,差異具有顯著性意義(P0.01)。但與窒息組相比,PDTC干預(yù)組細(xì)胞線粒體膜紅/綠熒光強(qiáng)度比值明顯升高,差異有顯著性意義(P0.01)。(3)用HSCORE系數(shù)作半定量評(píng)分,與正常對(duì)照組[(1.97±0.26)和(1.77±0.11)]相比,窒息組[(2.73±0.20)和(2.44±0.13)]和PDTC干預(yù)組[(2.38±0.13)和( 2.17±0.08)]促凋亡蛋白Bad、Bax的表達(dá)均明顯增加,差異具有顯著性意義(P0.01);但與窒息組相比,PDTC干預(yù)組促凋亡蛋白Bad、Bax的表達(dá)顯著減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。(4)正常組HK-2細(xì)胞的胞漿中不含細(xì)胞色素C,主要存在于線粒體內(nèi),條帶光密度值分別為(156.5±3.54,179.5±2.12);窒息組胞漿中細(xì)胞色素C從線粒體漏出較對(duì)照組明顯增加,相應(yīng)的在線粒體內(nèi)表達(dá)減少,條帶光密度值分別為(177.5±3.54,155±4.24),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);PDTC干預(yù)組胞漿中細(xì)胞色素C表達(dá)也有所增加,但大部分仍位于線粒體內(nèi),條帶光密度值分別為(165±4.24,171±5.66),與窒息組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(5)正常組HK-2細(xì)胞中AIF主要存在于線粒體內(nèi),條帶光密度值為(212±4.24);窒息組HK-2細(xì)胞中AIF從線粒體中漏出,在線粒體內(nèi)基本檢測(cè)不到AIF表達(dá),條帶光密度值為(128±4.24);PDTC干預(yù)組較窒息組線粒體內(nèi)AIF表達(dá)明顯增加,條帶光密度值為(201±8.49),組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論:新生兒窒息后血清可誘導(dǎo)人HK-2細(xì)胞凋亡,其胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制涉及到NF-κB活化后上調(diào)各種炎癥細(xì)胞因子、促凋亡Bcl-2家族蛋白表達(dá),從而使線粒體膜電位下降、耗散,線粒體膜間隙蛋白釋放,使凋亡進(jìn)入不可逆程序。提示穩(wěn)定線粒體膜功能,切斷凋亡級(jí)鏈反應(yīng)中的上游環(huán)節(jié)可能會(huì)減輕窒息后腎損傷的發(fā)生。
【學(xué)位單位】：瀘州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類(lèi)】：R722.12
【部分圖文】：

附圖 1 窒息后血清誘導(dǎo) HK-2 細(xì)胞損傷的形態(tài)學(xué)變化（倒置顯微鏡×200）(a)對(duì)照組； (b)窒息組； (c) PDTC 干預(yù)組。Figure 1 HK-2 microstructure changes induced by postasphyxial-serum; (a) Contro(b) Asphyxia group; (c) PDTC blocking group.

附 圖附圖 1 窒息后血清誘導(dǎo) HK-2 細(xì)胞損傷的形態(tài)學(xué)變化（倒置顯微鏡×200）(a)對(duì)照組； (b)窒息組； (c) PDTC 干預(yù)組。Figure 1 HK-2 microstructure changes induced by postasphyxial-serum; (a) Contro(b) Asphyxia group; (c) PDTC blocking group.

附圖 3 窒息后血清上調(diào) HK-2 細(xì)胞胞漿內(nèi) BAD 的表達(dá)（倒置顯微鏡×200）(a)對(duì)照組； (b)窒息組； (c) PDTC 干預(yù)組。Figure 3 Immunocytochemical analysis of proapoptotic protein Bad in HK-2 cells.(a) Control; (b) Asphyxia group; (c) PDTC blocking group.附圖 4 窒息后血清上調(diào) HK-2 細(xì)胞胞漿內(nèi) BAX 的表達(dá)（倒置顯微鏡×200）(a)對(duì)照組； (b)窒息組； (c) PDTC 干預(yù)組。Figure 4 Immunocytochemical analysis of proapoptotic protein BAX in HK-2 cells.(a) Control; (b) Asphyxia group; (c) PDTC blocking group.

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本文編號(hào)：2833825