第一部分孕期邊緣型維生素A缺乏對仔鼠肺結構和上皮發(fā)育的影響 目的:了解胚胎期開始的邊緣型維生素A缺乏(MVAD)對仔鼠生后不同時間點肺發(fā)育、肺泡結構和肺泡上皮的影響,以及在生后早期給予維生素A干預(VAI)對肺損傷的恢復程度。 方法:清潔級健康雌性Wistar大鼠18只隨機分為3組,飼以相應飼料,3周后與健康雄性Wistar大鼠交配,1:2雌雄合籠:(1)正常對照組(Control)(6只),給予VA充足飼料(含VA 6500 IU/kg),隨機抽取39只仔鼠用于本實驗,仔鼠飼料與母鼠相同;(2)MVAD組母鼠(6只),給予MVAD飼料(含VA 400 IU/kg) ,隨機抽取39只仔鼠用于本實驗,仔鼠飼料與母鼠相同;(3)生后干預組(VAI)(6只),給予MVAD飼料至分娩,然后改飼VA充足飼料,隨機抽取39只初生仔鼠用于本實驗,仔鼠于生后1天開始給予5倍RNI VA灌胃,每天一次連續(xù)7天,斷乳后換為正常飼料。各組仔鼠于出生時、生后2周、8周齡處死。記錄仔鼠體重和肺重,用高效液相色譜法(HPLC)檢測血清和肺組織VA濃度,形態(tài)定量學方法分析肺泡隔厚度,肺泡數(shù)量和肺泡表面積的改變,同時用半定量RT-PCR方法檢測肺泡上皮特有的表面活性物質相關蛋白SP-B,SP-CmRNA水平的變化。 結果:①血清VA濃度:MVAD母鼠交配時血清VA濃度明顯低于對照組,孕鼠和仔鼠未出現(xiàn)明顯VA缺乏的臨床表現(xiàn)。仔鼠生后各時間點血清VA濃度均低于Control組(P0.05),而肺組織VA濃度出生時和正常組無明顯區(qū)別,但2周和8周時低于正常組(P0.05)。VAI組生后2w血清VA濃度即恢復至正常,而肺組織VA濃度一直維持在穩(wěn)定水平,和正常組無明顯區(qū)別。②體重和肺重:MVAD組出生時、生后2周體重均明顯低于正常對照組(P0.05),8周時3組體重差異無統(tǒng)計學意義,但正常組和VAI組均略高于MVAD組。MVAD組仔鼠各時間點肺重均低于正常對照組(P0.05),VAI組8周時肺重恢復至正常水平。肺重/體重分數(shù)顯示各時間點三組間無差異,2周和8周時MVAD組和VAI組略高于正常對照組。③肺組織形態(tài)學定量分析:MVAD組仔鼠在各時間點肺泡隔均顯著厚于正常對照組(P0.05),2周和8周時肺泡表面積和肺泡數(shù)量均少于正常對照組(P0.05)。VAI組8周時除肺泡表面積仍少于正常對照組其余無明顯區(qū)別。④肺表面活性物質相關蛋白:正常對照組肺組織表面活性物質相關蛋白SP-B,SP-CmRNA水平生后1天、2周和8周無明顯區(qū)別,但MVAD和VAI組各時間點均高于Control組(P0.05)。 結論:①從胚胎期開始的MVAD會影響仔鼠肺發(fā)育過程,表現(xiàn)為肺重的減輕,肺泡隔增厚,肺泡數(shù)量和肺泡表面積的減少,可持續(xù)至成年期。②生后早期進行VA干預可以恢復大部分肺發(fā)育和結構的改變,但至成年期時肺泡表面積仍不能完全恢復至正常。③MVAD會導致肺泡上皮特有的表面活性物質相關蛋白SP-B,SP-C mRNA水平上調,而VAI組這種改變也不能恢復至正常水平。 第二部分孕期邊緣型維生素A缺乏對仔鼠肺基質的影響 目的:探討胚胎期開始的邊緣型維生素A缺乏(MVAD)對仔鼠生后不同時間點肺間質細胞外基質彈性纖維、膠原的結構和量的影響,以及在生后早期給予維生素A干預(VAI)的恢復程度。 方法:清潔級健康雌性Wistar大鼠18只隨機分為3組,飼以相應飼料,同第一部分。各組仔鼠于出生時、生后2周、8周齡處死。用醛品紅染色法檢測肺組織彈力纖維的分布,結構和量的改變,用Masson三色染色法觀察肺組織膠原纖維的分布,結構和量的改變,用堿水解法測定肺組織羥脯氨酸含量。 結果:①彈性纖維被染成紫紅色,沉積在肺泡間隔,細支氣管。生后1天MVAD組未發(fā)現(xiàn)彈性纖維的減少,但在2周和8周時明顯低于正常對照組(P0.05),彈性纖維結構粗糙不光滑。生后早期VA干預可以使彈力纖維恢復至正常組水平,結構也變得規(guī)則有序。②膠原被染成藍灰色,沉積在肺泡間隔,細支氣管及血管壁,排列整齊。MVAD組肺泡間隔、細支氣管、小血管膠原纖維明顯增多,互相交織呈網(wǎng)狀,著色較深,外表粗糙。MVAD組膠原蛋白的沉積在生后1天低于正常對照組,但在生后2周(P0.05)及8周(P0.05)時高于正常對照組,但是呈現(xiàn)的是無規(guī)律的形態(tài)。生后早期VA干預在2周及8周時能降低膠原的沉積,且形態(tài)規(guī)則。③隨著年齡增長各組仔鼠肺組織羥脯氨酸含量逐漸增加,MVAD組出生時羥脯氨酸略低于Control組,但差異無統(tǒng)計學意義,2周和8周時明顯增加(P0.05)。VAI組出生時略低于Control組,生后2周、8周和Control組相比無明顯差異。 結論:①從胚胎期開始的MVAD會影響仔鼠肺基質彈力纖維的結構和量,主要表現(xiàn)為生后彈力纖維的減少和結構的紊亂。②從胚胎期開始的MVAD會影響仔鼠肺基質膠原的分布和沉積,表現(xiàn)為生后2周和8周膠原纖維的過度沉積和結構紊亂,而羥脯氨酸也顯示膠原蛋白的增多。③而生后早期給予VA干預可以使彈力纖維和膠原結構和量恢復至正常水平。 第三部分孕期邊緣型維生素A缺乏影響仔鼠肺發(fā)育機制的研究 目的:進一步探討胚胎期開始的MVAD對仔鼠肺發(fā)育的影響是否通過調節(jié)其體內活性代謝物質RA的核受體RARs發(fā)揮作用。 方法:清潔級健康雌性Wistar大鼠18只隨機分為3組,飼以相應飼料,同第一部分。各組仔鼠于出生時、生后2周、8周齡處死。用半定量RT-PCR方法檢測肺組織RARα、β、γ的mRNA水平,用免疫熒光激光共聚焦方法觀察RARs在肺組織中的空間分布和表達量的改變,進一步用western-blotting方法了解RARs蛋白水平的變化及亞細胞定位。 結果:①生后正常肺組織中RARa mRNA表達最強,而RARγ表達最弱。RARa和RARβ均在出生時表達最強,隨著年齡的增長至成年期表達減弱,RARγ無明顯變化。MVAD對于RARa和RARβ的mRNA水平有明顯影響表現(xiàn)為轉錄水平的增強(P0.05)。②免疫熒光激光共聚焦顯示熒光強度變化與mRNA表達基本相符。生后RARs的空間定位主要為肺泡間隔的一些散在的細胞中,在支氣管和血管僅有少量的表達。而MVAD對于空間定位無明顯影響。③western-blotting的結果顯示MVAD組RARa和RARβ蛋白水平在2周和8周是明顯增加。提示VA對于RARs的轉錄水平和蛋白水平均有明顯的影響。而RARs蛋白的表達存在胞核向胞漿的轉移過程,表現(xiàn)為在8周肺泡發(fā)育結束時,RARa和RARβ也從胞核中轉移至胞漿。而RARs蛋白的亞細胞定位也受到VA營養(yǎng)狀態(tài)的影響,MVAD時胞核表達明顯增強,至8周時胞核內仍有表達。但生后早期的干預RARs mRNA、蛋白水平和亞細胞定位不能恢復至正常。 結論:①肺表達RARs受體的種類和量具有一定的年齡階段性,而這種特異性伴隨肺泡發(fā)育的全過程。不同年齡階段RARs的亞細胞定位存在從胞核至胞漿的轉移過程,而這一過程與生后肺泡發(fā)育的過程有明顯的相關性,這種轉移可能反應了蛋白轉化和成熟的改變,是RA功能多樣性的分子基礎。②RARs的量和定位明顯受到機體VA營養(yǎng)狀態(tài)的影響。MVAD可以導致RARs表達的增加,且胞核表達增加可能為機體的代償性的反應,而生后早期VA干預也不能使RARs的表達和定位完全恢復至正常水平,進一步提示孕期VA營養(yǎng)對于肺有序正常發(fā)育有重要的作用。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2008
【中圖分類】：R725.6
【部分圖文】：

而肺發(fā)育至完全成熟尚需延遲到出生以后的幼兒期，因此肺發(fā)育成熟的過程相對漫長(見圖1)。大鼠肺泡的發(fā)育在生后持續(xù)超過 21 天，生后的頭兩周是肺泡形成和分隔的重要時期[10]。肺泡的形成還需要間質和上皮細胞的相互作用，包括初級和次級肺泡隔向肺泡腔的突出以及形成新的肺泡隔所需要的細胞外結締組織框架結構的形成[11]。肺間質可以產生生長因子(EGF、TGF-α/β 和 FGF-7)以及基質分子(膠原、彈性蛋白以及蛋白多糖)，它們都能刺激上皮細胞分化和增殖，誘導肺臟的分支形成。同樣，上皮細胞也產生生長因子(PDGF、IGF、TGF-β 以及 MMPs)，并通過細胞—細胞間的接觸，誘導成纖維細胞增殖，出現(xiàn)基質的沉積。圖 1 人類肺發(fā)育過程的示意圖Fig 1 The process of lung development in human肺的分化、發(fā)育、生長和健康受到VA的影響[12]。已經有研究報道母鼠孕期VA缺乏(血漿VA濃度為0.26±0.03μmol/ L)會影響胎兒發(fā)育，導致肺重量減輕，支氣管發(fā)育異常，彈性蛋白的沉積也減少[13]。Christos等[14]從合籠開始給予雌性大鼠VAD的飼料，至孕20天時處死母鼠，此時血漿VA濃度為0.27~0.31μmol/L

I*圖1-6 肺組織HE染色(×100)。A,B,C: Control組生后1天，2周和8周. 觀察到肺組織生后肺泡化過程，至8周時發(fā)育成為肺泡數(shù)量多、更薄的肺泡隔和規(guī)則的肺泡結構的形態(tài)。D,E,F: MVAD組生后1天，2周和8周。肺泡隔明顯增厚，肺泡數(shù)量減少且形態(tài)不規(guī)則。G,H,I: VAI組l生后1天，2周和8周。8周時肺結構恢復至較薄的肺泡隔和規(guī)則的肺泡結構，但肺泡數(shù)量有減少。Figure 1-6 Slides of lung structure-HE (×100). A, B

圖 1-9 仔鼠肺組織 SP-B,SP-CmRNA 表達，MVAD 組和 VAI 組在生后各時間點均升高Fig 1-9 The SP-B, SP-CmRNA in lung of pups, increased in MVAD and VAI from postnatalday 1 to 8 weeks.

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 李紅梅,崔德健,馬楠,陸連榮,高亞兵,崔學梅,王德文;細胞外基質重塑在大鼠慢性阻塞性肺疾病模型氣流阻塞中的作用[J];中華結核和呼吸雜志;2002年07期

本文編號：2822812