發(fā)布時(shí)間：2020-09-19 15:04

　　 目的:探討轉(zhuǎn)染維甲酸受體α(retinoic acid receptorα,RARα)在腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E細(xì)胞)缺氧損傷后轉(zhuǎn)分化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)中的作用。方法:構(gòu)建過表達(dá)RARα慢病毒載體和陰性慢病毒載體,分別對(duì)體外培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。基因干擾72h后,以2.0 mg/L嘌呤霉素進(jìn)行篩選,采用熒光倒置相差顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。將NRK-52E細(xì)胞分為4組:正常對(duì)照組、缺氧模型組、轉(zhuǎn)染組、陰性病毒對(duì)照組。再將缺氧模型組、轉(zhuǎn)染組、陰性病毒對(duì)照組NRK-52E細(xì)胞進(jìn)行缺氧處理48小時(shí),正常對(duì)照組不做任何處理。采用光學(xué)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化,實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chainreaction,RT-qPCR)和蛋白免疫印跡法(western blotting,WB)檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞的RARα、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及波形蛋白(vimentin)的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果:1.熒光倒置相差顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染組、陰性病毒對(duì)照組的NRK-52E細(xì)胞均可見均勻綠色熒光并且細(xì)胞狀態(tài)良好,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)該兩組的轉(zhuǎn)染效率均97%。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞RARα的mRNA及蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組和陰性病毒對(duì)照組均顯著升高(均P0.05)。2.缺氧處理48小時(shí)后,光學(xué)倒置顯微鏡觀察到缺氧模型組與缺氧干預(yù)后的陰性病毒對(duì)照組NRK-52E細(xì)胞均出現(xiàn)萎縮,呈長(zhǎng)梭型,類似肌成纖維細(xì)胞形態(tài)改變;而缺氧干預(yù)后的轉(zhuǎn)染組NRK-52E細(xì)胞萎縮不明顯,細(xì)胞呈多方形,基本保留上皮細(xì)胞形態(tài)。3.與正常對(duì)照組相比,缺氧模型組NRK-52E細(xì)胞RARα、E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低(均P0.05),而α-SMA、vimentin的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高(均P0.05)。4.缺氧干預(yù)后的轉(zhuǎn)染組NRK-52E細(xì)胞RARα、E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)較缺氧模型組和缺氧干預(yù)后的陰性病毒對(duì)照組均顯著升高(均P0.05),而α-SMA、vimentin的mRNA和蛋白表達(dá)較缺氧模型組和缺氧干預(yù)后的陰性病毒對(duì)照組均顯著降低(均P0.05)。與缺氧模型組相比,缺氧干預(yù)后的陰性病毒對(duì)照組的NRK-52E細(xì)胞RARα、E-cadherin、α-SMA及vimentin的mRNA和蛋白表達(dá)均無顯著差異(均P0.05)。結(jié)論:RARα表達(dá)降低可能參與腎小管上皮細(xì)胞缺氧損傷后EMT,轉(zhuǎn)染RARα可減輕腎小管上皮細(xì)胞缺氧損傷后EMT的發(fā)生。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R726.9
【部分圖文】：

用過表達(dá)RARα慢病毒載體和陰性慢病毒載體以MOI值為10，分別感染NRK-52E細(xì)胞，并用2.0mg/L的嘌呤霉素篩選后，兩組細(xì)胞在熒光倒置相差顯微鏡下均可見均勻綠色熒光并且細(xì)胞狀態(tài)良好，見圖1-1。圖1-1 熒光倒置相差顯微鏡下NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)染后熒光表達(dá)情況（×200）Figure 1-1 The transfected NRK-52E cells were observed under fluorescent inverted contrast phasemicroscope(×200)A,B：分別在明場(chǎng)下，熒光下的轉(zhuǎn)染組；C,D：分別在明場(chǎng)下，熒光下的陰性病毒對(duì)照組A,B：transfection group cells were observed under light and fluorescent microscope; C,D: negative controlgroup cells were observed under light and fluorescent microscope

1.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率以正常對(duì)照組的NRK-52E細(xì)胞為空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染組及陰性病毒對(duì)照組的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均>97%，見圖1-2。圖1-2 流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率Figure 1-2 Flow cytometry was used to evaluate the transfection efficiency of NRK-52E cellsA：轉(zhuǎn)染組，B：陰性病毒對(duì)照組，C：正常對(duì)照組A: transfection group, B: negative control group, C: normal group1.3 慢病毒載體轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞后RARα的表達(dá)情況轉(zhuǎn)染組細(xì)胞RARα的mRNA表達(dá)量分別是正常對(duì)照組和陰性病毒對(duì)照組的6.42倍、9.58倍（均P <0.05），而蛋白表達(dá)量分別是正常對(duì)照組和陰性病毒對(duì)照組的1.81倍、1.98倍（均P <0.05）。與正常對(duì)照組相比，陰性病毒對(duì)照組細(xì)胞RARα的mRNA及其蛋白表達(dá)量均無顯著差異（均P >0.05）。見表1-1，圖1-3、1-4、1-5。

圖 1-3 NRK-52E 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后維甲酸受體 α 的 mRNA 表達(dá)mRNA expressions of retinoic acid receptor α in the transfect RARα+: transfection group; Neg.control: negative control gral group, P<0.05; #：compared with negative control group, 圖 1-4 NRK-52E 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后維甲酸受體 α 的蛋白表達(dá)rotein expressions of retinoic acid receptor α in the transfect

【參考文獻(xiàn)】

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1 Hong Zhao;Yanting Dong;Xinrui Tian;Thian Kui Tan;Zhuola Liu;Ye Zhao;Yun Zhang;David CH Harris;Guoping Zheng;;Matrix metalloproteinases contribute to kidney fibrosis in chronic kidney diseases[J];World Journal of Nephrology;2013年03期

2 ;Epithelial to mesenchymal transition in the progression of tubulointerstitial fibrosis[J];Chinese Medical Journal;2007年21期

3 易著文;陳丹;;腎小管上皮細(xì)胞損傷在腎小管間質(zhì)纖維化中的作用[J];實(shí)用兒科臨床雜志;2007年17期

4 陸海英;張悅;;腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及逆轉(zhuǎn)的分子機(jī)制[J];國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志;2006年01期

5 李薈,馬宏;腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化在腎間質(zhì)纖維化中的作用[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).泌尿系統(tǒng)分冊(cè);2005年03期

本文編號(hào)：2822658