目的：制備并評估新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(Necrotizing enterocolitis, NEC)新生大鼠腸道損傷后自我修復(fù)的模型。觀察新生大鼠NEC模型中腸道損傷修復(fù)過程中第10染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN)、腸道干細(xì)胞標(biāo)記物富含亮氨酸的G蛋白偶聯(lián)受體(eucine-rich-repeat-containing G-protein-coupled receptor 5, Lgr5)和腸道損傷修復(fù)過程中的重要因子β-連環(huán)蛋白(cadherin associated protein beta, P-catenin)的變化,探討PTEN、Lgr5和β-catenin在腸道缺血損傷與自我修復(fù)中的可能作用,為進(jìn)一步研究NEC發(fā)病機(jī)制、可能的治療方向提供思路。 第一部分制備與評估NEC腸道損傷后自我修復(fù)的新生鼠模型 方法：30只新生大鼠隨機(jī)分為對照組15只(A組)和實(shí)驗(yàn)組15只(B組)。實(shí)驗(yàn)組在生后第1d起給予缺氧和冷刺激,連續(xù)3d,再分別于停止缺氧和冷刺激后24h、72h和120h脫臼處死,分為B1、B2和B3組,每組5只。對照組未予缺氧和冷刺激,同時(shí)間段處死,分為A1、A2和A3組,每組5只。于實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)第4d分別測量兩組新生鼠體重,觀察體重變化情況。記錄實(shí)驗(yàn)組制模過程中新生鼠對刺激的反應(yīng),有無腹脹、胃潴留、活動(dòng)度下降等情況。處死后取新生鼠腸道組織標(biāo)本,H.E.染色,Nadler評分標(biāo)準(zhǔn)評估模型中新生鼠腸道粘膜損傷與修復(fù)情況。 結(jié)果：1.實(shí)驗(yàn)組新生鼠給予缺氧和冷刺激后相繼出現(xiàn)不同程度的活動(dòng)下降,進(jìn)奶量減少,輕到中度的腹瀉,可見明顯的腹脹和胃潴留,且在給予刺激的3d內(nèi)漸有加重,而在停止刺激后72h和120h癥狀又逐漸消失。 2.實(shí)驗(yàn)組在缺氧和冷刺激后體重增加量明顯低于對照組,P0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.大體解剖時(shí)發(fā)現(xiàn),對照組新生鼠腸壁色澤紅潤、彈性好；而實(shí)驗(yàn)組B1組部分腸段可見水腫、增厚及明顯的出血點(diǎn)；而B2和B3組腸壁色澤又趨于基本正常。 4.H.E.染色可見對照組回盲部絨毛結(jié)構(gòu)完整、粘膜完好、上皮完整、連續(xù)、腺體排列規(guī)則、組織結(jié)構(gòu)清楚、分泌功能活躍、固有層血管無擴(kuò)張,肌層無異常,無炎性細(xì)胞浸潤及潰瘍。實(shí)驗(yàn)組B1組腸粘膜和粘膜下層充血、水腫,固有層較多炎癥細(xì)胞浸潤,Nadler病理組織評分均在2-3級(jí)之間。B2和B3兩組腸粘膜損傷較B1組減輕,少量粘膜脫落,少量炎癥細(xì)胞浸潤,Nadler病理組織評分均在1-2級(jí)之間。 第二部分PTEN、Lgr5和β-catenin在NEC腸道損傷修復(fù)中的變化觀察 方法：制備和評估NEC腸道損傷與自我修復(fù)的新生鼠模型后,在實(shí)驗(yàn)組停止缺氧和冷刺激后24h、72h和120h,分別獲取不同組新生鼠末端回腸組織,利用Realtime PCR方法,測定組織勻漿中PTEN、Lgr5和β-catenin mRNA的表達(dá)水平。觀察腸道損傷后自我修復(fù)過程中PTEN、Lgr5和β-catenin的變化,分析三者之間的關(guān)系,探討三者可能的作用。 結(jié)果：1.實(shí)驗(yàn)組與對照組相比,在停止缺氧和冷刺激后24h時(shí),PTEN、Lgr5和β-catenin mRNA表達(dá)水平明顯升高,有顯著性差異(P=0.013；P=0.047；P=0.020),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.停止缺氧和冷刺激后72h和120h時(shí),實(shí)驗(yàn)組與對照組相比,PTEN.Lgr5和P-catenin mRNA表達(dá)水平不具顯著性差異(P=0.630,P=0.864；P=0.481,P=0.353；P=0.472,P=0.259),無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.實(shí)驗(yàn)組PTEN、Lgr5、β-catenin三者在24h時(shí)的表達(dá)水平無明顯差異(P=0.053；P=0.105；P=0.681),無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.實(shí)驗(yàn)組PTEN、Lgr5和β-catenin mRNA表達(dá)水平在24h時(shí)與72h和120h相比顯著升高(P=0.002,P=0.001；P=0.011,P=0.001；P=0.030,P=0.006),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5.實(shí)驗(yàn)組PTEN、Lgr5和β-catenin mRNA表達(dá)水平在72h與120h相比差異不大(P=0.941；P=0.525；P=0.746),無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：1、6%O2的N2,4℃冷刺激,成功制備新生大鼠NEC腸道損傷修復(fù)模型。 2、NEC模型后24h,腸道損傷期,PTEN、Lgr5和β-catenin mRNA表達(dá)水平明顯增加,顯著高于對照組。 3、NEC模型后72h與120h,腸道修復(fù)期,PTEN、Lgr5和β-catenin mRNA表達(dá)水平較24h明顯下降,與對照組比較,無顯著差異。 4、腸道損傷期,β-catenin表達(dá)水平增加,可能與促進(jìn)干細(xì)胞增殖有關(guān)。 5、PTEN負(fù)性調(diào)節(jié)β-catenin活性,可能在平衡干細(xì)胞增殖速度和數(shù)量上起到一定作用。
【學(xué)位單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類】：R722.1
【部分圖文】：

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)本收集!{寸程圖0001234567888

貧日大學(xué)碩十研究生學(xué)位論文PT巨N、Lg巧不lr日一Cat。ni，:在NEcj湯道損傷修艾‘}，的變化觀察瘤細(xì)胞生長、侵襲、轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，PTEN具有蛋白磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶雙重活性，能夠參與多種信號(hào)通路的調(diào)控，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、分化和凋亡。PTEN基因產(chǎn)物在誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡和血.管新生諸方面起著重要作用。其編碼的蛋白因具有雙重特異性磷酸酶活性，不僅加快磷酸酞肌醇3，4，5三磷酸(PhosPhatidylinositol3一kinases，PxP3)的03位脫磷酸，拮抗磷脂酞肌醇3激酶(Phosphatidylinositol3，4，5一triphosphate，pl3K)的磷酸化，減少PIP3的聚集;而且促使蛋白激酶B(Proteinkinase，Akt)磷酸酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸去磷酸，降低Akt的磷酸化水平。引起細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡〔’9〕，阻止腫瘤的惡性演變。PTEN不僅與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，在PTEN缺失的小鼠中，胎鼠死亡率明顯增高，因此PTEN在胚胎的發(fā)育中起重要作用〔川。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)下調(diào)PTEN能有效緩解由缺血再灌注所致的神經(jīng)元損傷「縱。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 魏克倫;楊于嘉;姚裕家;杜立中;王慶紅;;中國住院新生兒流行病學(xué)調(diào)查[J];中國當(dāng)代兒科雜志;2009年01期

2 申崇標(biāo);陳力學(xué);劉寶松;周冀英;曾照芳;邵陽;;下調(diào)PTEN基因?qū)θX缺血再灌注大鼠神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用研究[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2010年07期

本文編號(hào)：2820166