目的：隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展,嚴重威脅兒童的急性感染性疾病的發(fā)病率與死亡率已大幅下降,而惡性腫瘤已成為威脅兒童生命的主要疾病之一,其中血液腫瘤占絕大多數(shù),且發(fā)病率有逐年增高之勢。由于病因不明確,早期發(fā)現(xiàn)、對因治療受到限制,目前已成為兒童的主要殺手。化療仍是其治療的主要手段,近年來由于化療方案的不斷改進,長期生存率也有所升高,但仍有部分患兒不能緩解或復(fù)發(fā)。因而探索病因、尋求一種更為有效的防治措施對改善患兒的預(yù)后和生活質(zhì)量具有十分重要的意義。DNA甲基化是表觀遺傳修飾的重要組成部分,甲基化修飾異常在血液腫瘤發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。特異基因的異常甲基化可作為血液腫瘤的分子標志物,在臨床用于觀察療效及治療靶標。ZO-1(zonula occludens)基因所表達的是一種緊密連接蛋白,是膜相關(guān)鳥苷酸激酶家族成員之一,是維持細胞結(jié)構(gòu)完整和正常極性的必需蛋白,在細胞連接及信號傳導(dǎo)中起重要作用,參與調(diào)控細胞的增殖與分化。近年有學(xué)者應(yīng)用RLGS技術(shù)首次在鼠白血病細胞中發(fā)現(xiàn)ZO-1基因啟動子區(qū)呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài),導(dǎo)致該基因表達受抑,提示ZO-1可能是一個白血病相關(guān)基因。但目前國內(nèi)外尚無該基因在兒童血液腫瘤中的相關(guān)研究報道。本實驗通過檢測血液腫瘤患兒骨髓ZO-1基因甲基化情況,以探討其在兒童血液腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用,旨在尋找新的兒童血液腫瘤分子標志物，為臨床提供早期診斷、療效判定、預(yù)后分析、微小殘留病檢測及靶向治療的理論和實驗依據(jù)。 方法：將確診為白血病[急性淋巴細胞性白血病(ALL),急性髓細胞性白血病(AML),慢性粒細胞性白血病(CML)]、淋巴瘤[霍奇金病(HD),非霍奇金淋巴瘤(NHL)]及神經(jīng)母細胞瘤患兒治療前、化療前期、化療中期、化療后期、臨床緩解以及復(fù)發(fā)病例的骨髓標本作為研究組,非血液腫瘤患兒骨髓作為對照組。采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MS-PCR)方法,分別檢測研究組與對照組患兒骨髓中ZO-1基因的甲基化狀態(tài),逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測研究組與對照組ZO-1基因mRNA的表達情況,同時用ZO-1基因經(jīng)MS-PCR擴增后的甲基化條帶進行凝膠成像系統(tǒng)熒光強度半定量分析的熒光強度積分值(IOD值),觀察研究組化療過程中IOD的動態(tài)變化,并與外周血白細胞數(shù)及骨髓中惡性腫瘤細胞數(shù)進行相關(guān)性分析。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差((?)±S)表示并進行t檢驗,連續(xù)觀察數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析,計數(shù)資料用卡方檢驗或Fisher s確切概率法,兩因素之間的相關(guān)性采用直線相關(guān)分析。P0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1研究組與對照組比較：兩組年齡、性別均無顯著性差異(P0.05)。 2 MS-PCR檢測結(jié)果：研究組治療前共52例,有47例出現(xiàn)ZO-1基因甲基化條帶,陽性率為90.4%(47/52例),對照組共20例,無一例出現(xiàn),兩組比較,差異具有顯著性(P0.001)。其中淋巴瘤患兒為92.6%(25/27例),[NHL為95.2%(20/21例),HD為83.3%(5/6例)]；白血病為86.7%(13/15例),[ALL為100%(5/5例),AML為75%(6/8例),CML為100%(2/2例)]；神經(jīng)母細胞瘤為90%(9/10例)。各疾病及同一疾病不同分型間陽性率均無顯著性差異(P0.05)。動態(tài)觀察研究組39例(化療過程中有11例放棄治療,2例死亡,即共有39例可進行化療連續(xù)觀察),治療前甲基化陽性率為92.3%(36/39例),化療前期為84.6%(33/39例),化療中期為76.9%(30/39例),化療后期為69.2%(27/39例),臨床緩解13例,有5例仍可檢出,為38.5%(5/13例)。治療前與化療前期、中期比較均無顯著性差異(P0.05),與化療后期比較差異具有顯著性(P0.05)。隨著化療的進展,患兒骨髓逐步緩解,可以見到完全甲基化條帶減少,出現(xiàn)過渡性的部分甲基化條帶到消失�；熯^程中有2例復(fù)發(fā),ZO-1基因甲基化由部分甲基化條帶轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆谆瘲l帶。動態(tài)觀察研究組39例中,淋巴瘤21例,治療前ZO-1基因甲基化20例,陽性率95.2%(20/21例),化療前期17例,陽性率80.95%(17/21例),化療中期16例,陽性率76.2%(16/21例),化療后期14例,陽性率66.7%(14/21例),臨床緩解9例,有2例檢出,陽性率為22.2%(2/9例)。治療前與化療前、中期比較差異均無顯著性(P0.05),與化療后期比較,差異具有顯著性(P0.05)。有1例NHL患兒復(fù)發(fā),甲基化狀態(tài)由部分甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆谆�；白血�?1例,治療前ZO-1基因甲基化10例,陽性率90.9%(10/11例),化療前期10例,陽性率90.9%(10/11例),化療中期9例,陽性率81.8%(9/11例),化療后期8例,陽性率72.7%(8/11例),臨床緩解3例,有2例檢出,陽性率66.7%(2/3例)。治療前與化療前、中、后期比較差異均無顯著性(P0.05)。有1例急性早幼粒細胞白血病患兒復(fù)發(fā),甲基化狀態(tài)由部分甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆谆�；神�?jīng)母細胞瘤7例,治療前ZO-1基因甲基化6例,陽性率85.7%(6/7例),化療前期6例,陽性率85.7%(6/7例),化療中期5例,陽性率71.4%(5/7例),化療后期5例,陽性率71.4%(5/7例),臨床緩解1例,仍可檢出,陽性率100%(1/1例)。治療前與化療前、中、后期甲基化比較差異均無顯著性(P0.05)。達到臨床緩解的ZO-1基因甲基化檢出以神經(jīng)母細胞瘤和白血病較高。 3 RT-PCR檢測結(jié)果：研究組治療前52例提取總RNA,有5例見到ZO-1基因表達,陽性率為9.6%(5/52例)；對照組均有表達。兩組比較具有顯著性差異(P0.001),表明研究組治療前ZO-1基因表達沉默。動態(tài)觀察研究組39例ZO-1基因表達陽性率治療前為7.7%(3/39例),化療前期為15.4%(6/39例),化療中期為23.1%(9/39例),化療后期為30.8%(12/39例),臨床緩解13例,8例有ZO-1基因表達,陽性率為61.5%(8/13例)。治療前與化療前期、中期比較差異均無顯著性(P0.05),與化療后期比較差異具有顯著性(P0.05)。 4 IOD值檢測結(jié)果：研究組動態(tài)觀察治療前39例IOD值均數(shù)為20,715.87±10,854.81799,化療前期為12,183.64±7,093.12756,化療中期為9,703.744±6,938.87355,化療后期為5,669.667±4,761.52117,化療前、中、后期分別與治療前比較,均具有顯著性差異(P0.05),化療前、中、后期之間進行比較,差異亦具有顯著性(P0.001)。說明經(jīng)過化療后,ZO-1基因甲基化程度有所下降。 5研究組治療前IOD值相關(guān)性分析：52例中男、女性別IOD值比較無顯著性差異(P0.05)。年齡與IOD值無直線相關(guān)關(guān)系(P0.05)。外周血白細胞總數(shù)與IOD值無直線相關(guān)關(guān)系(P0.05)。骨髓中惡性腫瘤細胞數(shù)與IOD值呈直線相關(guān)關(guān)系(P0.001),且呈正相關(guān)。說明甲基化程度與性別、年齡、外周血白細胞數(shù)無關(guān),與惡性腫瘤細胞數(shù)密切相關(guān)。 結(jié)論： 1 ZO-1基因在兒童血液腫瘤中呈特異性高甲基化狀態(tài),無論在淋巴瘤、白血病、神經(jīng)母細胞瘤中均可檢測到,與兒童血液腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān),是預(yù)后不良因素之一。 2 ZO-1基因高甲基化狀態(tài)導(dǎo)致基因表達沉默,ZO-1基因有可能起到抑癌基因的作用。 3 ZO-1基因甲基化狀態(tài)與性別、年齡、外周血白細胞數(shù)無關(guān),、與骨髓惡性腫瘤細胞數(shù)有關(guān)。 4隨著化療的進行,ZO-1基因甲基化狀態(tài)在治療前后具有明顯變化,甲基化程度逐漸下降,臨床緩解的患兒仍有部分可檢測出,因此有可能成為新的分子標志,為臨床提供早期診斷、療效判定、預(yù)后分析、微小殘留病檢測的指標。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R733

【參考文獻】

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本文編號：2818027