目的通過對 MicroRNA 145、Adducin3 及 GBP-1 在膽道閉鎖(biliary atresia,BA)患兒肝臟組織中的表達(dá)水平變化,探討MicroRNA145-Adducin3通路及GBP-1在膽道閉鎖發(fā)病中增殖紊亂的作用及其作用機(jī)制。方法選取深圳市兒童醫(yī)院2013年1月至2016年1月收治的臨床及病理診斷為膽道閉鎖的患兒60例(研究組),對照組選取同期年齡在6個月之內(nèi)的非膽汁淤積性肝病且肝功能正常的患兒54例。第一部分:通過裂解研究組及對照組的肝組織并提取其總RNA后,分別用mRNA RT-PCR及MicroRNA RT-PCR法反轉(zhuǎn)錄、qPCR熒光定量分析法,檢測BA肝組織中的ADD3 mRNA及MicroRNA-145的表達(dá)水平。第二部分:構(gòu)建高表達(dá)MicroRNA-145、低表達(dá)Microma-145慢病毒,并分別轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞內(nèi),用RT-PCR反轉(zhuǎn)錄及qPCR熒光定量、western blot方法分別檢測不同MicroRNA-145表達(dá)量的細(xì)胞內(nèi)ADD3 mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平。第三部分:檢測GBP-1在不同程度肝臟纖維化肝臟組織中的表達(dá),并利用自動醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)對其進(jìn)行定量。第四部分:擬構(gòu)建GBP1基因慢病毒載體,轉(zhuǎn)染肝臟細(xì)胞從而上調(diào)其在肝臟細(xì)胞中的表達(dá),探討該基因高表達(dá)后對其下游因子尤其是MMPs表達(dá)的影響及對肝臟細(xì)胞的影響。結(jié)果第一部分:ADD3mRNA在BA組肝組織中表達(dá)量為4.638±0.3327,在對照組中表達(dá)為1.167 ± 0.1053;MicroRNA-145在BA組肝組織中表達(dá)為0.1578±0.03217,在對照組中表達(dá)為0.4557±0.1244。BA組肝組織中ADD3較對照組的明顯升高(p0.05),MicroRNA-145較對照組的明顯降低(p0.05)。第二部分:空白對照組的HepG2細(xì)胞內(nèi)存在ADD3 mRNA及蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)表達(dá)量,轉(zhuǎn)染高表達(dá)MicroRNA-145后的HepG2細(xì)胞,其ADD3mRNA水平及蛋白質(zhì)水平均較對照組細(xì)胞的低,而轉(zhuǎn)染低表達(dá)MicroRNA-145后的細(xì)胞,其ADD3mRNA水平及蛋白質(zhì)水平均明顯低于對照組細(xì)胞。第三部分:GBP1在對照組肝臟組織中呈陰性表達(dá);在BA肝臟組織中呈現(xiàn)不同程度表達(dá),隨著肝臟纖維化程度的加重,GBP-1表達(dá)水平增高。第四部分:TUNEL法檢測HepG2凋亡情況發(fā)現(xiàn),空載體質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染對照HepG2細(xì)胞未檢測到凋亡,而轉(zhuǎn)染Pcmv6-gbp1的HepG2細(xì)胞出現(xiàn)較多凋亡細(xì)胞。ELISA定量檢測發(fā)現(xiàn),MMP-1和MMP-2在pCMV6-gbp1轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞上清中表達(dá)降低,與對照組和空載體質(zhì)粒組統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論1、ADD3的過度表達(dá)可能與BA的發(fā)病相關(guān)。2、MicroRNA-145可能通過靶向作用于ADD3 3'UTR序列來改變ADD3的表達(dá),而誘發(fā)了 BA的發(fā)生。3、GBP1可能與BA肝臟組織肝纖維化密切相關(guān)。4、GBP1可能通過促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡和抑制MMP-1和MMP-2的表達(dá)而導(dǎo)致膠原酶降解減低,從而引起了 BA的發(fā)生。但由于本研究只是在細(xì)胞水平的研究,需要進(jìn)一步在動物水平上進(jìn)行驗證。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R725.7
【部分圖文】：

一章邋ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１４５－ＡＤＤ３通路參與膽道閉鎖發(fā)Ａ組肝組織呈高表達(dá)逡逑兒肝臟組織以及５４例對照組患兒肝臟組織，通水平，提示ＢＡ組患兒中的ＡＤＤ３ｍＲＮＡ表達(dá)義（２４．５９±５．８２７ｖｓ．０．４２３８±０．１５３５，ｐ＜０．０５）。ＡＤＤ３邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋Ｌｅｖｅｌ逡逑＜．

ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１４５表達(dá)水平。與內(nèi)參基因ＧＡＤＰＨ校正后，１４５表達(dá)水平明顯低于對照組患兒，具有統(tǒng)計學(xué)意義（ｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌ邋ｏｆ邋ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１４５邋ｉｎ邋ｌｉｖｅｒ邋ｔｉｓｓｕｅ．邋Ａｆｔｅｒ邋ｎｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌ邋ｏｆ邋ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１４５邋ｗａｓ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ邋ｌｏｗｅｒ邋ｉｎ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ邋（／？＝０．０２９２）．逡逑－１４５靶基因預(yù)測逡逑ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１４５在膽道閉鎖疾病中的可能靶基因來對ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１４５可能存在的靶點進(jìn)行預(yù)測［１ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１４５靶點，見圖丨－３。逡逑ｂ逡逑ｕｕａａｇＡＡＣＵＧＧＡＡａ邋ＡＤＤ３邐ｆ邋＞逡逑Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邐冬逡逑ｃｃｃｕｕＵＵＧＡＣＣＵｇ邋ｈａｓ－ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１４５－５ｐ逡逑？ｆｃ：邋＇．１４．２邋ｋｃ？ｌ／？？ｏｌ

ＨｅｐＧ２細(xì)胞ＡＤＤ３呈陰性表達(dá)，而轉(zhuǎn)染低表達(dá)ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１４５逡逑（ａｎｔｉ－ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１４５－Ｐｌ）和空載體質(zhì)粒（ｐＬＶＸ－ｖｅｃｔｏｒ）的邋ＨｅｐＧ２邋細(xì)胞邋ＡＤＤ３逡逑呈陽性表達(dá)，提示ｐｒｅ－ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１４５－Ｐｌ成功轉(zhuǎn)染（見圖２－３）。逡逑３１逡逑

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本文編號：2814080