【摘要】： 在過去的三十年中,哮喘等變應性疾病在世界范圍內明顯增加。據(jù)美國疾病控制和預防中心研究顯示,美國哮喘發(fā)病率從1980年到1994年增加了75%,以0～4歲兒童增加最明顯,高達160%。我國兒童哮喘發(fā)病情況亦不容樂觀,0～14歲兒童哮喘患病率1990年到2000年10年間從0.78 %上升到2.06 % ,增加了1.6倍。盡管遺傳因素與哮喘發(fā)生明確相關,由于人類遺傳背景短期內不可能發(fā)生明顯變化,因此哮喘明顯增加可能是環(huán)境因素改變的結果,這也正是“衛(wèi)生假說”的觀點。衛(wèi)生假說認為在西方國家由于公共衛(wèi)生設施改善、疫苗及抗生素使用以及腸道菌群改變,使感染發(fā)生率降低,微生物對嬰幼兒正在發(fā)育的免疫系統(tǒng)刺激作用減弱,造成哮喘等變應性疾病發(fā)生率大幅度升高。人類流行病學研究顯示,抗生素使用和腸道菌群改變與哮喘發(fā)病率升高相關。為了探討抗生素誘導腸道菌群失調和哮喘的關系,我們建立了抗生素誘導的腸道菌群失調小鼠模型,在該模型上采用煙曲霉菌變應原氣道激發(fā),以探討抗生素所致腸道菌群失調與氣道變應性反應的關系,并進一步在實驗性哮喘模型上了解腸道菌群失調對哮喘發(fā)作嚴重程度的影響以及在RSV感染動物模型上了解對RSV感染后肺部T輔助細胞極化方向的影響,評價抗生素誘導腸道菌群失調在哮喘等變應性疾病發(fā)生中的作用,為哮喘的防治提供理論依據(jù)。 目的:采用抗生素頭孢哌酮誘導小鼠腸道菌群失調,通過觀察小鼠細胞免疫和體液免疫以及TLR2、4基因表達變化,探討抗生素誘導小鼠腸道菌群失調后對機體適應性免疫和天然免疫的影響。 方法:60只4周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為2組:抗生素組和對照組,抗生素組小鼠連續(xù)7d口服頭孢哌酮,第7d經(jīng)口給予白色念珠菌。對照組用等量生理鹽水代替頭孢哌酮、白色念珠菌進行實驗。第8d每組小鼠隨機取10只用于盲腸內容物細菌培養(yǎng)計數(shù)、糞便含水量和體重變化的檢測,以了解腸道菌群失調情況。其余小鼠用于免疫功能檢測,包括脾指數(shù)、PHA誘導的脾臟淋巴細胞轉化實驗、遲發(fā)型超敏反應、抗體生成細胞數(shù)和PCR測TLR2、4 mRNA表達水平。 結果:⑴抗生素組小鼠腸道內腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌較對照組明顯減少,白色念珠菌增加,小鼠出現(xiàn)腸道菌群失調伴糞便含水量增加和體重減輕;⑵抗生素組小鼠脾指數(shù)(0.0035±0.0002)較對照組(0.0055±0.0008)降低;⑶抗生素組PHA誘導的脾臟淋巴細胞轉化率(0.0086±0.0016)較對照組(0.0147±0.0020)減少;⑷抗生素組小鼠經(jīng)綿羊紅細胞攻擊后足跖增加的厚度(0.094±0.013mm)較對照組(0.152±0.021mm)少;⑸抗生素組小鼠抗體生成細胞數(shù)(0.193±0.004)較對照組(0.215±0.007)低;⑹脾臟的TLR2和TLR4基因表達水平較對照組下調。 結論:抗生素誘導腸道菌群失調后小鼠細胞免疫功能和體液免疫功能以及TLR2、TLR4 mRNA表達均降低,說明天然免疫和適應性免疫應答能力均降低,提示抗生素致腸道菌群失調對機體免疫功能有明顯影響。 第二部分抗生素誘導腸道菌群失調與變應性氣道反應的關系研究 目的:在抗生素所致腸道菌群失調小鼠模型上采用煙曲霉菌變應原氣道激發(fā),誘導氣道變應性反應,探討抗生素誘導腸道菌群失調與氣道變應性反應的關系。 方法:40只雌性BALB/c小鼠分為4組,每組10只。①抗生素組:口服頭孢哌酮7 d,第7d給予50μl白色念珠菌1次,9、16 d經(jīng)鼻給予50μl生理鹽水;②激發(fā)組:1～7 d給予等量生理鹽水代替頭孢哌酮和白色念珠菌,9、16 d經(jīng)鼻給予煙曲霉菌變應原50μl;③抗生素加激發(fā)組:前7d處理同抗生素組,9、16 d經(jīng)鼻給予煙曲霉菌變應原50μl;④對照組:1～7 d給予等量生理鹽水代替頭孢哌酮和白色念珠菌,9、16 d經(jīng)鼻給予50μl生理鹽水。所有小鼠于第19d檢測BALF中細胞總數(shù)和分類計數(shù)、細胞因子INF-γ和IL-4水平、肺部病理和轉錄因子GATA-3和T-bet mRNA表達。 結果:⑴激發(fā)組和抗生素加激發(fā)組小鼠BALF中細胞總數(shù)、淋巴細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞增加,尤以抗生素加激發(fā)組小鼠更為明顯;⑵抗生素加激發(fā)組小鼠BALF中IL-4(45.35±2.36pg/ml)水平較對照組(35.32±2.53 pg/ml)增加,IFN-γ水平無明顯變化;⑶4組小鼠肺組織病理學顯示均無明顯炎癥浸潤;⑷肺組織中轉錄因子GATA-3 mRNA表達水平(0.57±0.023)比對照組(0.41±0.020)高,T-bet/GATA-3比值(0.58±0.021)較對照組(0.80±0.035)降低。 結論:抗生素致腸道菌群失調小鼠經(jīng)過煙曲霉菌變應原氣道激發(fā),可致Th2優(yōu)勢的氣道變應性反應,提示抗生素致腸道菌群失調是誘發(fā)哮喘等變應性疾病發(fā)生的危險因素。 第三部分抗生素誘導腸道菌群失調在實驗性小鼠哮喘模型上的效應觀察 目的:采用OVA致敏和激發(fā)建立實驗性哮喘模型,在致敏階段用抗生素誘導腸道菌群失調,探討抗生素致腸道菌群失調對哮喘發(fā)作嚴重程度的影響。 方法:54只小鼠分為3組,每組18只。哮喘組采用OVA致敏和激發(fā);抗生素加哮喘組也采用OVA致敏和激發(fā),在OVA致敏過程中加用抗生素和白色念珠菌誘導腸道菌群失調;對照組采用對照佐劑致敏和PBS激發(fā),處理同哮喘組。激發(fā)結束后檢測BALF中細胞總數(shù)和分類計數(shù),ELISA檢測細胞因子IFN-γ和IL-4水平、肺組織病理評分以及流式細胞儀檢測肺部DC亞型和成熟度。 結果:⑴經(jīng)過OVA致敏和激發(fā),小鼠出現(xiàn)喘息癥狀,BALF中細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和巨噬細胞均較對照組顯著升高,IFN-γ水平降低,IL-4水平升高,肺組織可見明顯炎癥,說明OVA致敏和激發(fā)建立的實驗性哮喘模型成功;⑵和哮喘組比較,抗生素加哮喘組小鼠喘息癥狀、BALF中細胞總數(shù)和分類計數(shù)、IFN-γ和IL-4水平、肺部病理評分以及肺部DC亞型無顯著差異;肺部DC成熟度有顯著差異。 結論:抗生素誘導腸道菌群失調在實驗性哮喘模型上對肺部DC成熟度有明顯影響,但抗生素誘導腸道菌群失調對肺部免疫狀態(tài)的影響很小,不足以影響哮喘發(fā)作的嚴重程度。 第四部分抗生素誘導腸道菌群失調在RSV感染小鼠模型上對肺部免疫狀態(tài)的影響 目的:在RSV感染小鼠模型上采用抗生素致腸道菌群失調后,煙曲霉菌變應原氣道激發(fā)誘導氣道變應性反應,探討感染RSV后用抗生素誘導腸道菌群失調對RSV感染后肺部Th1/Th2極化方向的影響。 方法:54只BALB/c小鼠分為3組,每組18只。RSV組小鼠鼻腔接種RSV,感染后9d和16d經(jīng)鼻給予煙曲霉菌變應原氣道激發(fā);抗生素加RSV組小鼠鼻腔接種RSV后連續(xù)口服抗生素頭孢哌酮7d,感染后7d經(jīng)口給予白色念珠菌,感染后9d和16d進行煙曲霉菌變應原氣道激發(fā)。對照組小鼠鼻腔滴入等量病毒培養(yǎng)液,滴鼻后9d和16d進行煙曲霉菌變應原氣道激發(fā)。RSV感染后19d檢測BALF中細胞總數(shù)和分類計數(shù),ELISA檢測細胞因子水平、肺組織病理評分以及流式細胞儀檢測肺部DC亞型和成熟度。 結果:⑴小鼠感染RSV后,BALF接種到Hep-2細胞可以引起典型CPE,直接免疫熒光證實肺部有RSV抗原,BALF中細胞總數(shù)升高,以淋巴細胞增加為主,肺部可見明顯炎癥,說明RSV感染小鼠模型建立成功;⑵與RSV組比較,抗生素加RSV組小鼠BALF中細胞總數(shù)和分類計數(shù)、IL-4、IL-10和IFN-γ水平、肺部病理評分以及肺部DC亞型和成熟度無顯著差別。 結論:抗生素誘導腸道菌群失調和氣道變應原激發(fā)并不改變RSV感染后肺部Th1/Th2細胞的極化方向。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R725.6

【引證文獻】

相關博士學位論文 前1條

1 孫大慶;腸道菌群失調致肺部過敏反應作用機制的實驗研究[D];重慶醫(yī)科大學;2010年

本文編號：2802992