【摘要】：研究背景新生兒窒息是指由于圍生期的各種原因使新生兒出生后不能建立正常呼吸,引起缺氧、酸中毒,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致全身多臟器損害的一種病理生理狀況。其本質(zhì)是缺氧,當(dāng)造成腦部供血供氧不足時(shí),可表現(xiàn)出如抽搐、意識改變、肌張力異常等癥狀,稱為缺氧缺血性腦病。我國活產(chǎn)嬰兒每年1800-2000萬,窒息發(fā)生率為13.6%,發(fā)生不同程度傷殘率為15.6%。遠(yuǎn)期不僅可遺留神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥如腦癱、學(xué)習(xí)記憶障礙等,還可能出現(xiàn)永久性的內(nèi)分泌改變?nèi)绱贵w功能減退癥。有學(xué)者甚至認(rèn)為垂體功能減退癥有50-60%有圍產(chǎn)期窒息或臀位產(chǎn)等異常分娩史。垂體功能減退癥是指一種或一種以上的垂體激素缺乏,多伴有小垂體,垂體后葉異位或缺如(ectopic posterior pituitary, EPP),垂體柄發(fā)育不全(pituitary stalk abnormality, PSA),垂體柄變細(xì)中斷甚至消失等垂體形態(tài)的改變。我們研究發(fā)生窒息后腦損傷的垂體激素水平的變化并結(jié)合垂體MRI的影像學(xué)檢查,希望能夠早期發(fā)現(xiàn)垂體功能減退癥的患兒,并給予干預(yù),以防影響生存質(zhì)量。缺氧缺血性腦病多為繼發(fā)于窒息造成的損傷,這種全身性缺氧缺血是種強(qiáng)烈的應(yīng)激刺激,可造成體內(nèi)多種激素水平發(fā)生變化。對于這些激素水平的變化機(jī)制及發(fā)揮的作用,我們試圖通過體外細(xì)胞培養(yǎng)以模擬體內(nèi)的病理狀況去研究和解釋。對于垂體激素水平的改變是否會(huì)造成垂體形態(tài)的改變,如垂體體積、垂體前葉信號、垂體高度等,將行垂體MRI檢查以闡明。在新生兒領(lǐng)域,關(guān)于垂體測量的數(shù)據(jù)報(bào)道較少,我們的數(shù)據(jù)將有助于積累這方面資料。垂體激素除了熟知的內(nèi)分泌功能外,還參與免疫調(diào)節(jié),神經(jīng)保護(hù),水電平衡的調(diào)節(jié)等。我們選擇從對神經(jīng)保護(hù)作用方面進(jìn)一步研究。垂體激素中催乳素(PRL, prolactin)是近20年來受關(guān)注較多的激素之一,它是由腺垂體泌乳細(xì)胞所分泌的一種蛋白質(zhì)類激素,與生長激素(GH)、胎盤催乳素(HPL)和增殖蛋白(Proliferin)屬同一家族。其結(jié)構(gòu)相似,具有類似的生物學(xué)作用,可影響生長發(fā)育、生殖內(nèi)分泌及調(diào)節(jié)免疫等。催乳素通過與其受體結(jié)合,繼而激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用,同時(shí)又與其它多種激素和受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相互作用,產(chǎn)生復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)。本研究擬體外培養(yǎng)大鼠神經(jīng)元細(xì)胞系和原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元,探討催乳素調(diào)控MAPKs和AKT信號通路對神經(jīng)元的保護(hù)機(jī)制。從而加強(qiáng)對催乳素的認(rèn)識,以期發(fā)現(xiàn)缺氧缺血性腦病治療的分子靶點(diǎn)。第一部分新生兒缺氧缺血性腦病垂體激素變化及其意義目的探討新生兒缺氧缺血性腦病垂體前葉激素水平變化及其意義。方法1、收集泰安市中心醫(yī)院自2013-05至2015-05期間住院治療的80例有窒息史的新生兒缺氧缺血性腦病患兒為觀察對象。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)于2005年制定的HIE分度標(biāo)準(zhǔn)分為3組,輕度組(n=35)、中度組(n=25)、重度組(n=20);對照組為無窒息史和其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新生兒30例。分別于入院6小時(shí),48小時(shí),7天抽取外周靜脈血,測定血中下丘腦-垂體-腎上腺軸上的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(adrenocorticotropic hormone, ACTH )、皮質(zhì)醇(cortisol,COR);下丘腦-垂體-生長激素軸上的生長激素(Growth hormone,GH),胰島素樣生長因子(Insulin growth factor-1, IGF-1)的水平;下丘腦-垂體-甲狀腺軸上促甲狀腺素(Thyroid-stimulating hormone, TSH),游離三碘甲狀腺原氨酸(Free triiodothyronine, FT3),游離甲狀腺素(Free thyroxine, FT4)的水平;下丘腦-垂體-性激素軸上卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone,FSH),促黃體生成素(Luteinizing hormone,LH),泌乳素(Prolacin,PRL),雌激素(Estradiol,E2),睪酮(Testosterone, T)的水平,對各組間的激素水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,對不同時(shí)間點(diǎn)的激素水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析。2、80例病人重度組2例死亡,完成隨訪78例于3個(gè)月時(shí)進(jìn)行Gesell發(fā)育量表評估,并根據(jù)評估情況分為預(yù)后不良組與預(yù)后良好組,復(fù)查垂體激素水平GH、TSH、LH、FSH、ACTH、PRL,進(jìn)行兩組間的比較。結(jié)果80例HIE患兒及30例對照組均計(jì)入結(jié)果分析。在新生兒出生后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(6h、48h、7 d)檢測到的新生兒血液中垂體激素水平的變化如下1、對生長激素軸的影響對GH的影響:隨著HIE程度的加重,3個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測到新生兒血液中GH的水平均先增加后降低,與對照組相比較,差異顯著(P0.015)。對IGF-1的影響:隨著HIE程度的加重,6, 48h檢測到新生兒血液中IGF-1的濃度均呈下降趨勢,與對照組相比較,差異均顯著(P0.05)。至7天,輕中度組恢復(fù)至與正常對照無明顯差異,重度組未能恢復(fù)。2、對甲狀腺軸的影響對FT3的影響:隨著HIE程度的加重,3個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測到新生兒血液中FT3的濃度呈下降趨勢,與對照組相比較,差異均不顯著(P0.05)。對FT4的影響:重度HIE患兒,6, 48h時(shí)間點(diǎn)檢測到新生兒血液中FT4的濃度均呈下降趨勢,與對照組相比較,差異顯著(P0.05)。至7天,輕中度組基本恢復(fù)至與正常對照無明顯差異,重度組未能恢復(fù)。對TSH的影響:新生兒出生后,隨著時(shí)間的推移,新生兒血液中TSH水平有下降趨勢;中重度HIE組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測到新生兒血液中TSH的濃度較對照組、輕度組明顯下降,差異顯著(P0.05)。3、對性腺軸的影響對LH的影響:重度HIE組患兒3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均檢測到血液中LH的水平明顯下降,與對照組相比較,差異顯著(P0.05)。對FSH的影響:重度HIE組患兒3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均檢測到FSH水平的下降,與對照組相比較,差異顯著(P0.05)。對PRL的影響:隨著HIE程度的加重,3個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測到新生兒血液中PRL的水平均呈上升趨勢,與對照組相比較,差異均顯著(P0.05)。對E2、T的影響:新生兒出生后,隨著時(shí)間的推移,新生兒血液中E2、T的水平有升高趨勢;隨著HIE程度的增加,3個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測到新生兒血液中E2、T的濃度無明顯變化,與對照組相比較,差異均不顯著(P0.05)。4、隨訪至3個(gè)月發(fā)現(xiàn),預(yù)后不良組主要來自重度組病人,預(yù)后不良組GH、TSH、LH的變化較對照組明顯降低,PRL升高。結(jié)論1、HIE患兒存在不同程度的垂體前葉激素分泌的紊亂。輕中度患兒多可在1周恢復(fù)正常水平。重度HIE早期激素水平改變顯著,且恢復(fù)較慢。監(jiān)測激素水平變化有助于了解病情嚴(yán)重程度。2、HIE可引起生長激素軸上GH水平先升高后下降,GH是應(yīng)激激素。IGF-1水平隨缺氧缺血的嚴(yán)重程度而下降,與病情嚴(yán)重程度有相關(guān)性。3、HIE可引起性激素軸上的PRL明顯升高,HIE程度越高,PRL升高越明顯,二者呈正相關(guān)。4、HIE可引起甲狀腺軸上TSH下降,FT3、FT4下降。5、預(yù)后不良組GH、TSH、LH的變化較對照組明顯降低,PRL升高。這幾種激素對于預(yù)后有一定的預(yù)測價(jià)值。第二部分新生兒缺氧缺血性腦病垂體的MR表現(xiàn)目的研究足月缺氧缺血性腦病新生兒垂體形態(tài)、體積、垂體前葉信號強(qiáng)度。方法選取我院2013-05至2015-05收治的符合新生兒缺氧缺血性腦病標(biāo)準(zhǔn)的患兒80例,根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)于2005年制定的HIE分度標(biāo)準(zhǔn),分為輕(n=35)、中(n=25)、重度(n=20)三組,同時(shí)選取30例對照組,對照組無內(nèi)分泌疾病,無宮內(nèi)窘迫史。于生后7-10天行垂體MRI檢查。使用德國Siemens Avanto 1.5T磁共振掃描儀行顱腦檢查,選擇T1WI系列垂體正中矢狀位層面,測量垂體高徑,腺垂體前后徑,垂體前葉信號強(qiáng)度及同層面橋腦橄欖核信號強(qiáng)度比值。在冠狀位層面測量垂體冠狀寬徑和高徑,代入公式π/6×(腺垂體前后徑X冠狀高徑×冠狀寬徑)計(jì)算垂體體積。結(jié)果其中重度HIE組兩例死亡,未完成MRI檢查,實(shí)驗(yàn)組共78例。1. HIE輕中重度組垂體上緣呈上凸型的分別占88.5%,88%,88.8%,與對照組90%無顯著差異。2.垂體體積均值在輕、中、重三組與對照組相比無明顯差異。3.垂體前葉信號強(qiáng)度與橋腦橄欖核比值在HIE重度組明顯降低,與HIE輕中度組及對照組相比有顯著差異(p0.05)。4.垂體各徑線在HIE輕中重度組及對照組無明顯差異(P0.05)。結(jié)論1.缺氧缺血性腦病對垂體上緣形態(tài)無明顯影響。2.輕中度缺氧缺血性腦病對新生兒垂體體積和垂體前葉信號強(qiáng)度無明顯影響。3.重度缺氧缺血性腦病可伴有垂體前葉信號的減退。第三部分催乳素(PRL)調(diào)控MAPKs和AKT通路對神經(jīng)元的保護(hù)機(jī)制目的有文獻(xiàn)報(bào)道,催乳素在體內(nèi)可通過調(diào)控MAPKs和AKT信號通路治療大鼠/小鼠腦缺血損傷,促進(jìn)神經(jīng)再生和修復(fù),是潛在的神經(jīng)保護(hù)劑,然而其分子機(jī)制仍不清楚。本研究擬體外培養(yǎng)大鼠神經(jīng)元細(xì)胞系和原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元,探討催乳素調(diào)控MAPKs和AKT信號通路對神經(jīng)元的保護(hù)機(jī)制。方法體外培養(yǎng)大鼠起源的海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22細(xì)胞和大鼠原代海馬神經(jīng)元MTT方法檢測催乳素對HT22細(xì)胞活性的影響,并評價(jià)PRL抑制氧糖剝奪誘導(dǎo)的神經(jīng)元毒性及機(jī)制Western blotting方法檢測MAPKs和AKT信號通路蛋白的表達(dá)情況結(jié)果1. MTT結(jié)果表明:催乳素在12.5-800 ng/ml的劑量范圍內(nèi)對HT22細(xì)胞活性無顯著影響,細(xì)胞形貌、細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞之間的連接無顯著變化;催乳素體外對原代神經(jīng)元無顯著細(xì)胞毒性;催乳素體外可顯著促進(jìn)神經(jīng)元生長、延長神經(jīng)元生存。2.催乳素體外可顯著抑制氧糖剝奪誘導(dǎo)的神經(jīng)元毒性,表現(xiàn)為神經(jīng)元活性的升高;.抑制氧糖剝奪誘導(dǎo)的神經(jīng)元形貌的改善,表現(xiàn)為軸突的變長、分支變多,延長神經(jīng)元體外存活時(shí)間。3. Western blotting結(jié)果表明:催乳素劑量依賴性和時(shí)間依賴性激活了 MAPKs通路,表現(xiàn)為90 min內(nèi)p-ERK的持續(xù)激活,對p-p38和p-JNK的磷酸化激活無顯著影響;催乳素可顯著減弱氧糖剝奪對p-AKT和p-ERK的抑制;其次,催乳素處理HT22細(xì)胞,時(shí)間依賴性和劑量依賴性誘導(dǎo)了 p-AKT的持續(xù)激活;PI3K/AKT抑制劑和MEK/ERK抑制劑的加入,進(jìn)一步證實(shí)了催乳素對MAPKs和AKT信號通路的調(diào)控作用。結(jié)論1.催乳素對體外神經(jīng)元細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性;體外可顯著抑制氧糖剝奪誘導(dǎo)的神經(jīng)元毒性。2.催乳素可劑量依賴性和時(shí)間依賴性激活MAPKs中p-ERK的表達(dá),對p-JNK和p-p38的表達(dá)無顯著影響。3.催乳素可劑量依賴性和時(shí)間依賴性激活p-AKT的表達(dá)。4.催乳素可能是通過調(diào)控MAPKs和PI3/K信號通路促進(jìn)神經(jīng)元生存,抑制神經(jīng)元凋亡,進(jìn)而起到神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲得,將為催乳素治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R742
【圖文】：

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圖３．３．２邋ＨＩＥ新生兒各組ＦＴ３水平逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2802168