【摘要】： 敗血癥(sepsis)是一種嚴重的細菌性感染疾病,在新生兒中具有較高的死亡率,發(fā)病隱匿,臨床癥狀無特異性。因此,尋找一種快速、準確的敗血癥早期診斷方法,對指導臨床治療、降低患兒死亡率、改善預后,具有十分重要的意義。目前,細菌培養(yǎng)是作為“金標準”在診斷臨床細菌性病原微生物標本,然而該方法缺乏快速和敏感性。在本研究中,我們分析細菌16s rRNA基因序列,在其保守區(qū)設計通用引物和革蘭陰、陽性菌分型探針,建立了細菌革蘭雙檢熒光定量PCR新方法,并對臨床的相關標本進行了檢測。本研究分二部分:第一部分,細菌革蘭雙檢熒光定量PCR技術的建立;第二部分,細菌革蘭雙檢熒光定量PCR技術臨床應用。 第一部分細菌革蘭雙檢熒光定量PCR技術的建立 方法: 分析臨床常見菌16S rRNA基因序列,在高度保守區(qū)自行設計通用引物和革蘭陽性和陰性分型探針,建立細菌革蘭陰、陽性菌雙通道熒光定量PCR檢測體系,選取臨床較常見的53株臨床分離株(25株為革蘭陽性菌、28株為革蘭陰性菌)進行細菌革蘭雙檢熒光定量PCR方法檢測,以評價該方法探針的特異性;以金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌分別代表革蘭陽性和陰性菌進行濃度梯度稀釋,稀釋品進行該方法的檢測以評價細菌革蘭雙檢熒光定量PCR的敏感度和線性關系。 結果: 細菌革蘭雙檢熒光定量PCR具有較好的敏感性和特異性,最低能檢測到3個金黃色葡萄球菌,而大腸桿菌可以檢測低到1個細菌數(shù)。53株臨床培養(yǎng)分離株進行該方法檢測:25株革蘭陽性菌株通過革蘭陽性探針(FAM-G~+探針)檢測均為陽性,28株革蘭陰性菌株通過革蘭陰性探針(VIC-G~-探針)檢測均為陽性,反之均為陰性,符合率100%。巨細胞病毒、EB病毒、乙肝病毒,新型隱球菌及白色念珠菌,人基因組DNA及空白對照均為陰性。 結論: 建立了用通用弓J物和分型雙熒光探針的細菌革蘭雙檢熒光定量PCR方法。其檢測快速、準確,具有較大的臨床推廣應用和臨床指導用藥價值。 第二部分細菌革蘭雙檢熒光定量PCR技術臨床應用 方法: 用建立的細菌革蘭雙檢熒光定量PCR方法對1000例臨床疑似為敗血癥的患兒血標本和125份擬診為化膿性腦膜炎的腦脊液標本,進行該方法的檢測,同時進行細菌培養(yǎng)對照實驗,檢測結果進行統(tǒng)計學分析。 結果: 1.在1000例血標本中,細菌革蘭雙檢熒光定量PCR共檢出64例陽性標本,其中革蘭陽性菌40例,革蘭陰性菌24例,陽性率為6.40%(64/1000);血培養(yǎng)共檢出50例陽性,陽性率為5.00%(50/1000),陽性率前者高于后者,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。 2.在125份腦脊液標本中,細菌革蘭雙檢熒光定量PCR共檢出17份陽性,其中革蘭陽性菌為10份,革蘭陰性菌為7份,陽性率為13.6%(17/125);腦脊液細菌培養(yǎng)共檢出6份陽性,陽性率為4.8%(6/125);陽性率前者顯著高于后者,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。 3.以細菌培養(yǎng)為對照,對血標本和腦脊液標本進行匯總,細菌革蘭雙檢熒光定量PCR的檢測敏感度為91.07%,特異性為97.36%,約登指數(shù)為0.8843,檢測符合率為97.05%,kappa值0.89。 結論: 建立的細菌革蘭雙檢熒光定量PCR技術新方法用于臨床標本(包括血、腦脊液)的檢測,具有快速、特異、敏感的特點,可為臨床早期、準確診斷敗血癥和化腦等細菌性感染疾病提供新方法。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R725.1
【圖文】：

與此同時該28株革蘭陰性菌在FAM通道(FAM一G十探針)均為陰性(表l)。人巨細胞病毒、EB病毒、乙肝病毒，新型隱球菌、白色念珠菌、人基因組DNA以及空白對照等檢測結果均為陰性(圖2.1，2.2，2.3)鑿鑿忿輝盟黔哩望矍罐寒耀哪檬辮群擎卿豁瞬麟麒姍瀚 !!!隊 隊M一G一通i笆一一卡 卡一 一‘人~一一一一一一一‘癡高‘‘‘盆一____山一一一一一 一圖2.1表皮葡萄球菌革蘭雙檢熒光定量圖{TI，:二滬鉀尸，、.，，，1.

空白對照組革蘭雙檢熒光定量圖

對上述構建的金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌 165rRNA基因重組質粒進行測序驗證，經(jīng)與基因庫中相應細菌序列比較，其同源性均大于98%(部分測序圖見圖2.4，2.5)。分別取該重組質粒經(jīng)紫外分光廣度計初步定量后的濃度梯度標準品loo/ul一ros/ul進行細菌革蘭雙檢熒光定量PcR，結果發(fā)現(xiàn)革蘭陽性菌探針對金黃色葡萄球菌的重組質粒從10’/ul一1護/ul具有良好的線性關系，而革蘭陰性菌探針對大腸埃希菌的重組質粒從100/ul一105/ul均具有良好的線性關系(圖2.6，2.7)o1001101201301叨1501‘01，0圖2.4金黃色葡萄球菌部分序列分析圖100C人GC人C1101201301401501601，0ll

【參考文獻】

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本文編號：2801441