【摘要】：研究目的： 采用TaqMan-MGB實(shí)時(shí)熒光RT-PCR (real-time reverse transcriptase PCR, real-time RT-PCR)檢測臨床樣本中人偏肺病毒(human metapneumovirus, hMPV)N基因的方法,并進(jìn)一步用傳統(tǒng)RT-PCR擴(kuò)增陽性樣本cDNA以進(jìn)行基因序列分析；用直接免疫熒光(direct immunofluorescence assay, DFA)的方法對(duì)引起兒童急性下呼吸道感染(acute low respiratory tract infection, ALRTI)的呼吸道合胞病毒(RSV),腺病毒(ADV),A、B型流感病毒(IFV),1、2及3型副流感病毒(PIV)等7種常見呼吸道病毒抗原進(jìn)行檢測；以了解上海地區(qū)ALRTI患兒中呼吸道病毒感染狀況及hMPV在上海地區(qū)流行株的分子流行病學(xué)特點(diǎn)；通過對(duì)同期標(biāo)本中支原體、沙眼衣原體熒光定量PCR檢測結(jié)果及細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)結(jié)果的調(diào)查,較清晰的揭示2006年10月至2008年2月期間本地區(qū)兒童ALRTI的病原譜構(gòu)成比與變化特點(diǎn)。 對(duì)象及方法： 1.收集2006年10月到2008年2月確診為ALRTI住我院48小時(shí)內(nèi)共1347例的患兒深部鼻咽分泌物(nasopharyngeal secretion, NPS)1347份標(biāo)本。 2.用TaqMan-MGB實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測隨機(jī)挑選(每周二、四采集)的622份NPS標(biāo)本中人偏肺病毒(hMPV) RNA,陽性標(biāo)本進(jìn)一步用傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行基因序列分析。熒光RT-PCR的上游引物為5'-CATCAGGTAATATCCCACAAAATCAG-3',下游引物為5’-GTGAATATTAAGGCACCTACACATAATAA-3',探針為FAM-5’-TCAGCACCAGACACAC-NFQMGB-3';測序傳統(tǒng)PCR的上游引物為5’-AACCGTGTACTAAGTGATGCACTC-3',下游引物為5’-CATTGTTTGACCGGCCCCATAA-3'。 3.用直接免疫熒光法方法檢測1347份NPS中的呼吸道合胞病毒(RSV),腺病毒(ADV),A、B型流感病毒(IFV),1、2及3型副流感病毒(PIV)抗原。 4.對(duì)各種病毒在小兒ALRTI中所占比例、性別、年齡、季節(jié)分布及臨床特點(diǎn)進(jìn)行臨床流行病學(xué)分析,并對(duì)hMPV檢測及測序結(jié)果進(jìn)行分子流行病學(xué)分析。基因序列分析用BLAST和DNAMAN軟件對(duì)hMPV核苷酸序列作比較,并繪制基因進(jìn)化樹。 5.調(diào)查同期標(biāo)本中支原體、衣原體熒光PCR檢測結(jié)果及細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)結(jié)果。 結(jié)果： 1. TaqMan-MGB實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測hMPV基因共檢測出24份陽性標(biāo)本,檢出率為3.86%,陽性樣本cDNA用另一對(duì)引物進(jìn)一步用傳統(tǒng)RT-PCR擴(kuò)增,16份標(biāo)本陽性；隨機(jī)選取5份傳統(tǒng)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序,測得的核苷酸序列經(jīng)過BLAST比較,與GeneBank中已知hMPV序列的同源性在84%～100%之間；用DNAMAN軟件進(jìn)行基因分析發(fā)現(xiàn),5份樣本序列在進(jìn)化樹中聚類為2簇；5份樣本基因序列變異性可表現(xiàn)為核苷酸的點(diǎn)突變,也可是臨近幾個(gè)堿基同時(shí)突變,甚至有單個(gè)或臨近幾個(gè)堿基的核苷酸缺失及插入突變。 2.622例患兒中,3月齡以下兒童hMPV檢出率0.94%(2/213),3月齡到6足月以下兒童檢出率3.95%(3/76),6月齡到1足歲以下兒童檢出率2.73%(3/110),1歲到2足歲以下兒童檢出率9.52%(6/63),2歲到5足歲以下兒童檢出率6.98%(9/129),5歲以上兒童檢出率3.23%(1/31)。2歲以下兒童占58.33%(14/24),5歲以下兒童占95.83%(23/24)。hMPV致ALRTI絕大多數(shù)在11月份到次年1月份之間(21/24)。2006-2007年冬季hMPV檢出率6.60%(14/212),2007-2008年冬季hMPV檢出率1.11%(2/180)。男性323例患兒中檢測出hMPV陽性10例(3.10%),女性237例患兒檢出hMPV陽性14例(5.91%)，男女檢出率無差異(X2=2.63,P0.05)。 3.1347份標(biāo)本中7種常見病毒共檢出率為33.56%(452/1347),hMPV檢出率為3.86%(24/622),總的病毒檢出率35.19%(474/1347)；細(xì)菌檢出率為24.64%(329/1335),支原體和衣原體檢出率分別為7.85%(103/1312)和2.97%(39/1312),1347份標(biāo)本總的病原學(xué)檢出率為55.23%(744/1347),其中混合感染率為15.59%(210/1347),2份標(biāo)本hMPV與RSV同時(shí)陽性,9份標(biāo)本存在3種病原體同時(shí)感染。有44.77%的臨床標(biāo)本病原未明。 4.RSV檢出率為28.36%(382/1347),為最常見的感染原。2006-2007年冬季RSV檢出率31.16%(124/398),2007-2008年冬季RSV檢出率38.59%(120/311)；2007年春季、夏季、秋季RSV檢出率分別為21.05%(36/171)、8.64%(7/81)和31.40%(92/293)。2歲以下兒童為RSV最易感人群。3月齡以下兒童檢出率36.36%(184/506),3月齡到6足月以下兒童檢出率31.58%(72/228),2歲以下兒童占91.88%(351/382),5歲以下兒童占98.69%(377/382)。RSV陽性患兒多有喘息表現(xiàn)。 5.PIV檢出率為2.82%(38/1347),低于RSV和hMPV;ADV檢出率為1.86%(25/1347)；IFV檢出率為1.19%(16/1347)；少見混合性病毒感染。 6.支原體和衣原體檢出率分別為7.85%(103/1312)和2.97%(39/1312)。支原體在5歲以上兒童中的檢出率為34.5%,衣原體在3月齡以下兒童中的檢出率為6.8%。 結(jié)論： 1. TaqMan-MGB實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測hMPV基因具有快速、操作簡便、敏感度高的特點(diǎn),可應(yīng)用于臨床檢測。2006年10月至2008年2月本地區(qū)存在兩種基因型hMPV流行。 2.2006年10月至2008年2月上海地區(qū)ALRTI兒童NPS中hMPV的檢出率為3.86%,2006-2007年冬季較2007-2008年冬季檢出率高。hMPV所致兒童ALRTI以5歲以下小年齡兒童多見。 3.病毒病原在本地區(qū)兒童ALRTI中占有重要地位；2歲以下兒童ALRTI以病毒性感染為主,2歲以上到5歲以細(xì)菌性感染為主,到5歲以上則以支原體感染占優(yōu)勢。3月齡以下衣原體有6.28%的檢出率,值得關(guān)注。 4.2歲以下兒童為RSV最易感人群；在本地區(qū),2007-2008年冬季較2006-2007年冬季RSV有較強(qiáng)的流行；RSV感染更易表現(xiàn)有喘息癥狀。 5.2006年10月至2008年2月本地區(qū)兒童ALRTI中,8種病毒檢出率為35.19%,細(xì)菌檢出率為24.64%,支原體和衣原體檢出率分別為7.85%和2.97%,仍有44.77%的臨床標(biāo)本病原未明。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R725.6

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本文編號(hào)：2799584