【摘要】：目的:先天性肛門直腸畸形(Anorectal Malformations,ARMs)是最常見的小兒消化道畸形,是世界衛(wèi)生組織常規(guī)監(jiān)測的先天畸形之一,占消化道畸形的1/4,發(fā)病率為1/1000~1/1500。盡管長期不斷改進手術(shù)方式,挽救了患兒的生命,但術(shù)后肛門直腸功能的恢復面臨很大的挑戰(zhàn),至少有1/3的患兒術(shù)后存在不同程度的便失禁和便秘等排便功能障礙,并需要終生進行治療,嚴重影響患兒的生活質(zhì)量、心理發(fā)育,給患兒、家庭和社會帶來沉重的負擔。研究人員已經(jīng)逐漸意識到肛門直腸畸形病理改變復雜,術(shù)后肛門直腸功能不良取決于許多因素。前期課題組提出了先天性肛門直腸畸形腰骶段脊髓神經(jīng)發(fā)育存在異常,并提出排便中樞所在的脊髓發(fā)育異常是導致先天性肛門直腸畸形術(shù)后排便功能障礙的重要原因之一。同時,提出了對于先天性肛門直腸畸形要進行恢復神經(jīng)功能的治療新思路。研究已經(jīng)證實,在肛門直腸畸形患者及胎鼠模型中,肛門直腸存在畸形的同時多伴隨發(fā)生不同程度的腰骶段脊髓發(fā)育異常。有研究表明高中位肛門直腸畸形患兒骶髓前角運動神經(jīng)元神經(jīng)元數(shù)量較正常兒減少,無肛患兒在組織學上存在骶髓發(fā)育不良。而在ARMs動物模型的研究中發(fā)現(xiàn),支配肛提肌的感覺神經(jīng)元、運動神經(jīng)元以及支配直腸的副交感神經(jīng)元在大鼠胚胎期便存在發(fā)育異常,神經(jīng)元數(shù)目明顯減少、神經(jīng)元發(fā)育不良,是無肛畸形的神經(jīng)病理改變之一。但是,迄今為止,ARMs神經(jīng)元發(fā)育異常的胚胎發(fā)生機制尚不清楚。因此本研究采用高通量測序的方法在全轉(zhuǎn)錄組水平上篩查ARMs胚胎腰骶髓中異常表達的基因,探討神經(jīng)元異常發(fā)育的機制。脊髓神經(jīng)發(fā)育過程需要遷移、增殖、分化、凋亡的等一系列細胞活動的參與,而這些細胞活動受到多種信號組成的復雜網(wǎng)絡(luò)嚴格調(diào)控。其中,骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic,BMP)、無翅型MMTV整合位點(the wingless-type MMTV integration site,WNT)、聲猬因子(Sonic hedgehog,Shh)信號在神經(jīng)前體細胞分化過程中發(fā)揮著重要作用。BMP、WNT信號在脊髓背側(cè)中間神經(jīng)元區(qū)域表達最高,促使神經(jīng)前體細胞向中間神經(jīng)元方向分化。Shh在運動神經(jīng)元區(qū)域表達最高,對于維持運動神經(jīng)元和膠質(zhì)神經(jīng)元分化、軸突導向、突觸形成起到了重要的作用。位于脊髓平面不同區(qū)域的BMP、WNT和Shh家族成員,濃度不同,相互協(xié)同或拮抗,共同維持各種神經(jīng)細胞的分化、遷移、增殖、軸突導向以及和靶器官建立聯(lián)系,這一過程的任一環(huán)節(jié)發(fā)生改變均可導致神經(jīng)元的發(fā)育異常。在脊髓發(fā)育過程中,凋亡起到了非常重要的作用。凋亡可以清除神經(jīng)管中多余的神經(jīng)前體細胞以及沒能有效建立突觸連接的神經(jīng)元。這個過程會促使神經(jīng)元的數(shù)目適配其所支配的靶器官,并且對于保持神經(jīng)系統(tǒng)的生理形態(tài)和功能起到了非常重要的作用。經(jīng)典的中樞神經(jīng)細胞凋亡理論認為過多的神經(jīng)細胞凋亡是由于靶器官的發(fā)育不良引起的,靶器官發(fā)育不良而不能產(chǎn)生足夠的神經(jīng)營養(yǎng)因子反饋給中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細胞。這個過程清除了所謂的“無用”的神經(jīng)細胞,而只有較少的神經(jīng)細胞存活。課題組前期的研究顯示,ARMs胎鼠胚胎形成過程中,盆底肌肌細胞過度凋亡、橫紋肌復合體和肛門內(nèi)括約肌發(fā)育不良,而支配這些靶器官的腰骶髓內(nèi)神經(jīng)元數(shù)目顯著減少,但是凋亡是否發(fā)生異常改變目前尚不清楚,所以我們推測神經(jīng)元的過度凋亡在ARMs胎鼠腰骶異常發(fā)育過程中發(fā)揮了重要的作用。針對ARMs胚胎腰骶髓神經(jīng)發(fā)育不良,本研究進行了骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)移植,探索ARMs神經(jīng)修復治療方案。神經(jīng)損傷的修復極其困難,近年來利用MSCs移植治療脊髓損傷和神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病已經(jīng)取得不錯的成果,但是在先天性神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用卻少有報道。許多研究證實,MSCs同定植部位神經(jīng)細胞間的相互作用,可通過自分泌或旁分泌的方式產(chǎn)生一些細胞因子,如神經(jīng)營養(yǎng)因子、白細胞介素類、干細胞因子等。這些細胞因子對神經(jīng)功能的恢復具有促進作用。MSCs還具有向病變組織定向遷移和發(fā)生位點特異性分化能力,可以向神經(jīng)細胞方向分化,替代損傷部位神經(jīng)元,有利于神經(jīng)功能的修復。MSCs同定植部位神經(jīng)細胞間的相互作用特性,非常適合先天性肛門直腸畸形脊髓發(fā)育異常的治療,并且將是一個改善ARMs術(shù)后肛腸功能障礙的很有發(fā)展前景的治療策略。本文應(yīng)用乙烯硫脲(ethylenethiourea,ETU)對Wistar大鼠進行致畸,建立肛門直腸畸形動物模型,探索正常胎鼠及ARMs胎鼠腰骶髓發(fā)育過程中差異表達的基因、Shh-Ptch1-Gli1時空表達存在的差異和神經(jīng)細胞凋亡情況,同時提取MSCs經(jīng)過體外培養(yǎng)增殖后移植入ARMs胎鼠發(fā)育異常的腰骶髓區(qū)域,并在移植后觀察脊髓神經(jīng)細胞凋亡改善情況和分化情況,探索MSCs移植治療ARMs胎鼠發(fā)育異常的腰骶髓的可行性。研究方法:1、動物模型制備及標本收集。Wistar大鼠,體重250~300 g,10~12周齡,由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院實驗動物中心提供,雌雄鼠以5:l比例交配,次日清晨陰道涂片,置于顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)載玻片上有精子者則定為孕0天(E0),于E10經(jīng)胃管注入1%ETU(125 mg/kg)致畸,制作ARMs大鼠動物模型,對照組給予等量的生理鹽水。選擇E16、E17、E19、E21四個時間點,用10%水合氯醛(3.2 ml/kg)腹腔注射麻醉孕鼠,然后剖宮取胎收集標本組織,一部分標本放于4%多聚甲醛溶液中進行固定,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,常溫保存,用于切片進行免疫組化染色和TUNEL染色;一部分用生理鹽水和多聚甲醛對胎鼠進行心臟灌注。取其腰骶髓放入4%多聚甲醛中固定,然后放入20%的蔗糖中脫水48h,放入-80℃冰箱避光保存,用于切片進行免疫熒光染色和TUNEL染色。一部分標本在解剖顯微鏡下取腰骶髓組織,深度冰箱凍存,用于Western Blotting及RT-qPCR(Quantificational reverse transcriptase-polymerase)實驗。2、全轉(zhuǎn)錄組測序篩查ARMs胎鼠與正常胎鼠的腰骶段脊髓中差異表達的基因。在E17取對照組及ARMs組腰骶段脊髓組織,進行全轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒?上海伯豪生物技術(shù)有限公司提供)。預測對照組和ARMs組中可能存在的差異表達的基因和非編碼RNA以及二者之間的相互作用;并運用RT-qPCR對其中與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的差異表達的基因進行驗證。3、Shh-Ptch1-Gli1在兩組大鼠胚胎腰骶髓發(fā)育過程中時空表達的研究。運用RT-qPCR技術(shù)對在正常組和ARMs組大鼠胚胎發(fā)育過程中腰骶髓中Shh-Ptch1-Gli1的mRNA表達水平進行定量分析;應(yīng)用Western Blotting的方法對Shh-Ptch1-Gli1蛋白進行定量分析;應(yīng)用免疫組化方法觀察Shh-Ptch1-Gli1蛋白在大鼠胚胎晚期腰骶髓發(fā)育過程中的時空表達模式。初步探索三種基因在腰骶髓發(fā)育過程中可能起到的作用。4、神經(jīng)細胞凋亡及Bcl2/Bax在兩組大鼠胚胎腰骶段脊髓發(fā)育過程中表達的研究。應(yīng)用TUNEL染色觀察大鼠胚胎晚期腰骶段脊髓發(fā)育過程中神經(jīng)細胞的凋亡情況;運用RT-qPCR技術(shù)對在正常組和ARMs組大鼠胚胎發(fā)育過程中腰骶段脊髓中Bcl2/Bax的mRNA表達水平進行定量分析;應(yīng)用Western Blotting的方法對Bcl2/Bax蛋白進行定量分析;應(yīng)用免疫組化方法觀察Bcl2/Bax蛋白在大鼠胚胎晚期腰骶段脊髓發(fā)育過程中的時空表達模式。探索神經(jīng)細胞凋亡和Bcl2/Bax基因在腰骶段脊髓發(fā)育過程中可能起到的作用。5、MSCs移植修復ARMs胎鼠發(fā)育不良的腰骶髓。從4周齡的Wistar大鼠股骨分離骨髓間充質(zhì)干細胞,應(yīng)用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞。傳代后移植入ARMs胎鼠的腰骶段脊髓區(qū)域,觀察移植MSCs后ARMs胎鼠腰骶髓神經(jīng)細胞分化和凋亡情況,探索子宮內(nèi)移植骨髓間充質(zhì)干細胞治療ARMs胎鼠發(fā)育不良的腰骶髓的可行性。6、統(tǒng)計分析。所有的實驗數(shù)據(jù)均以均值±標準差來表示,應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,各胎齡正常組與ARMs組差異的比較采用t檢驗,相關(guān)性采用Pearson檢驗,統(tǒng)計值p0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果:1、高通量測序檢測蛋白編碼基因的同時,預測大量差異的lncRNA和circRNA,并進行差異RNA篩查(篩查條件為:Fold Change≥2.0,p≤0.05)結(jié)果顯示:mRNA中,ARMs組較Normal組下調(diào)基因53個,上調(diào)基因41個;LncRNA中,ARMs組較Normal組下調(diào)63個,上調(diào)49個。CircRNA中,ARMs組較Normal組下調(diào)48個,上調(diào)31個。運用RT-qPCR技術(shù)對其中與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的差異基因和部分lncRNA進行驗證,結(jié)果顯示RT-qPCR的結(jié)果與RNA-Seq檢測和預測結(jié)果趨勢基本一致。2、高通量測序結(jié)果顯示Shh基因在ARMs胎鼠中表達異常,通過對比研究Shh-Ptch1-Gli1蛋白及mRNA在兩組胚胎胚胎腰骶段脊髓組織中的時空表達,發(fā)現(xiàn)Shh/Ptch1在E17到達高峰,Gli1在E21達到高峰,Shh-Ptch1-Gli1表達主要集中在脊髓腹側(cè)。而在ARMs組,與對照組相同時間點相比,Shh-Ptch1-Gli1表達明顯減弱,但是表達趨勢與正常組一致。3、高通量測序結(jié)果顯示細胞凋亡相關(guān)基因Bax在ARMs胎鼠腰骶髓中異常表達,提示其神經(jīng)元凋亡可能異常。進一步通過對比研究兩組胚胎腰骶髓神經(jīng)細胞凋亡情況,顯示ARMs組凋亡指數(shù)(AI)明顯上升,在E19天達到高峰。對Bcl2/Bax蛋白及mRNA的定性及定量研究表明,與正常組相比,ARMs胎鼠腰骶髓中Bcl2表達減弱,Bax表達明顯增強。且Bcl2/Bax蛋白表達量比值與AI呈明顯負相關(guān)趨勢。4、提取的骨髓間充質(zhì)干細胞在體外培養(yǎng)后48h后傳代至P3-P6,移植到ARMs胎鼠腰骶髓區(qū)域,對比研究Synapsin和GFAP的mRNA和蛋白、神經(jīng)細胞凋亡在對照組、ARMs組和MSCs+ARMs組三組大鼠胚胎腰骶髓組織中的時空表達。與對照組相比,Synapsin在ARMs組明顯表達減少,而移植MSCs后,雖然Synapsin表達顯著增多,但是較對照組比較表達顯著降低。與對照組相比,GFAP在ARMs組顯著表達升高,而移植MSCs后,雖然GFAP表達顯著降低,但是較對照組比較表達顯著升高。通過對比研究三組胚胎腰骶髓神經(jīng)細胞凋亡情況,顯示ARMs組凋亡指數(shù)(AI)明顯上升,MSCs+ARMs組AI較ARMs組明顯下降,但仍顯著高于對照組。結(jié)論:1、大鼠腰骶段脊髓胚胎期發(fā)育是一個非常復雜的過程。高通量測序結(jié)果提示對照組和ARMs組中差異表達的mRNA,lncRNA和circRNA基因較多,除了有較多信號傳導通路參與,還有mRNA-miRNA-lncRNA、mRNA-miRNA-circRNA共表達網(wǎng)參與調(diào)控,這些差異表達的RNA,如Shh和Bax及其所在的信號傳導通路和共表達網(wǎng)可能是導致ARMs胎鼠腰骶段脊髓異常發(fā)育的原因。2、E16-E21,Shh-Ptch1-Gli1表達主要集中在前角區(qū)域,Shh-Ptch1-Gli1在ARMs組腰骶髓中的表達較正常組弱,Shh-Ptch1-Gli1的低表達可能與ARMs腰骶髓異常發(fā)育有關(guān)。3、E16-E21,ARMs組腰骶段脊髓中神經(jīng)細胞凋亡顯著增多,并且以前角為主,Bcl2在ARMs組腰骶段脊髓中的表達較正常組減弱,Bax在ARMs組腰骶段脊髓中的表達較正常組增強,Bcl2/Bax表達異常可能與ARMs腰骶段脊髓神經(jīng)細胞凋亡顯著增多有關(guān)。4、MSCs移植后,ARMs腰骶段脊髓神經(jīng)突觸增多,神經(jīng)膠質(zhì)細胞減少,神經(jīng)細胞凋亡減少,說明MSCs移植可以影響局部的微環(huán)境及信號分子傳遞,使神經(jīng)細胞增殖及分化。MSCs在一定程度上能夠修復ARMs胎鼠發(fā)育不良的腰骶段脊髓。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R725.7
【圖文】：

若胎鼠的肛凹位置無肛門開口，且無肉眼可見脊柱裂和脊膜膨出者，則認為該胎鼠存在肛門直腸畸形，納入 ARMs 組（圖 3.1A-D）其中用于高通量測序?qū)嶒灥脑惺螽a(chǎn)胎鼠情況：正常組 3 只孕鼠總共獲得胎鼠36 只，未見畸形發(fā)生。ARMs 組 6 只孕鼠總共獲得胎鼠 68 只，其中肛門直腸畸形胎鼠 32 只（47.02%：34/68）納入 ARMs 組。其余胎鼠腰骶髓組織收集后用于RT-qPCR 驗證以及其他相關(guān)實驗。對照組的每只孕鼠可獲得符合條件的胎鼠 11-13 只，為減少由于組內(nèi)樣本來源不同而引起的誤差，本實驗收集來源于同一只孕鼠的所有胎鼠，取得其腰骶髓組織組成一個對照組樣本，同理可取得三個對照組樣本，即三個生物學重復。ARMs 組由于每只母鼠致畸后能取得的符合肛門直腸畸形的胎鼠樣本為 5-6 只，所以選擇飼養(yǎng)條件、受孕時間相同的兩只母鼠并為一組，其胎鼠數(shù)目約為 10-11只，收集其腰骶髓組織組成一個 ARMs 樣本，按這個方法共收集三個 ARMs 樣本，即三個生物學重復（圖 3.1E）。

胎鼠腰骶髓組織后，按母鼠來源分組，即收集對照組的三個生物學重復 N1,N2,N3.ARMs 組六只母鼠(a1,a2,a3,a4,a5,a6),倆倆（a1,a2 一組,a3,a4 一組,a5,a6 一組）一組，每組產(chǎn)符合肛門直腸畸形條件的鼠 10,11,11 只，取 ARMs 胎鼠腰骶髓后，按母鼠分組來源分組，即收集 ARMs組的三個生物學重復 A1,A2,A3。（*為母鼠名稱，&為胎鼠數(shù)量，^為收集的標本分組名稱。）3.2 RNA-Seq 預測差異表達 RNA于 E17 取 ARMs 組及對照組腰骶段脊髓組織各個生物學重復樣本，進行RNA-Seq 預測（上海伯豪生物提供）。篩選條件為 Fold Change ≥2.0，p-value ≤0.05；ARMs 組與正常組相比,下調(diào) mRNA53 個，上調(diào) mRNA41 個。下調(diào) lncRNA63 個，上調(diào) lncRNA49 個。下調(diào) circRNA48 個，上調(diào) circRNA31 個。3.2.1 差異 mRNA 信息差異 mRNA（Differential expression mRNA，DE mRNA）信息如下：

圖 3.3 E17 天腰骶髓組織差異表達基因的 GO 功能分類統(tǒng)計圖（level 2）從 GO 富集分析結(jié)果可知（圖 3.4），前五位的功能條目分別是：chylomicron、very-low-desity lipoprotein particle、fibrinolysis、protein-lipid complex 和 neutrallipid catabolic process。

【參考文獻】

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本文編號：2797558