【摘要】： 目的研制早期快速檢測抗腸道病毒71型(EV71)抗體的ELISA血清學診斷性試劑盒,評價其臨床應用價值。 方法將表達純化的EV71重組蛋白VP1作為包被抗原,建立EV71型手足口病間接ELISA法的血清學檢測方法。通過與逆轉錄(RT)PCR方法、EV71病毒分離試驗和微量血清中和試驗比較,評價抗-EV71 IgM和抗-EV71 IgG血清學診斷方法在EV71型手足口病的診斷價值,并進行臨床考評。 結果與RT-PCR比較,抗-EV71 IgM敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為83%,85%,81%和87%;抗-EV71 IgG敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為72%,74%,68%和77%。與EV71病毒分離方法比較,抗-EV71 IgM敏感度、特異度分別為85%和97%;抗-EV71 IgG敏感度、特異度分別為75%和77%。通過直線相關分析發(fā)現,抗-EV71 IgG抗體滴度和中和抗體滴度呈顯著正相關(r =0.72,P0.001)。EV71型手足口病患兒恢復期血清抗IgG滴度較急性期升高(P0.001),但抗IgM滴度差異無統計學意義(P=0.287)。重復試驗變異系數小于10%。臨床100份樣本檢測,抗EV71IgM抗體靈敏度與特異度均超過85%。試劑放置4周后,檢測結果穩(wěn)定。 結論利用VP1重組蛋白作為包被抗原,成功開發(fā)ELISA檢測人血清抗-EV71 IgM和抗-EV71 IgG抗體的診斷試劑盒。
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R725.1
【圖文】：

檢測抗 EV71 EV71IgM,IgG 抗體手足口病 EV71 抗體診斷性試劑盒V71 流行病學調查，EV71 陽性患者愈后抗體持續(xù)水平研究離及鑒定染細胞后，大多能引起細胞病變（cytopathic effect，CPE），、壞死、破碎或脫落，EV71的CPE現象無需染色便可直接在觀察，記錄時+代表25%以下細胞發(fā)生病變，++代表50%左右+代表75%左右，++++代表100%左右細胞發(fā)生病變。圖1顯示所出現的CPE現象。某些病毒在初次接種后便出現明顯CPE，續(xù)3－4次傳代后才能出現，若超過5代仍沒有出現CPE，則證敗，或者樣本中根本就沒有所要分離的病毒。

結 果細胞（CPE）的細胞（圖 2）制備抗原片，加入用間接免疫熒光法鏡檢病毒。熒光顯微鏡下觀察熒光為黃綠色顆粒，分布在感染細胞的胞漿內熒光為陰性。（圖 2C）

17圖3 腸道病毒（EV71、CA16）RT-PCR電泳圖注：A 圖為腸道病毒EV71電泳圖 B 圖為腸道病毒CA16電泳圖A1 陽性條帶 A2 陰性條帶 A3 陽性對照 A4 陰性對照 AM Marker DL100B1 陰性對照 B2 陽性對照 B3 陰性條帶 B4 陽性條帶 BM Marker DL20003.3 表達重組VP1蛋白3.3.1 VP1基因的擴增和重組pET-21b(+)-VP1陽性質粒的鑒定提取EV71 流行株的病毒RNA作為PCR擴增模板進行RT-PCR，電泳結果顯示可以擴增出891bp左右特異的V P1基因片段(圖1A)。pET-21b:VP1陽性重組質粒分別經EcoR I和Hind III進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分別見到約891bp和5.5kb兩條片段(圖1B)。以重組陽性質粒為模板，利用PCR擴增出大小約891bp的特異性片段(圖1C)。重組質粒pET-21b:VP1經測序，確定重組質粒pET-21b:VP1中正確插入VP1基因，表明重組質粒pET-21b:VP1構建成功。3.3.2 VP1重組蛋白的表達、純化與鑒定表達的重組菌裂解液經12％SDS-PAGE電泳分離，Coomassie blue 染色后，在約35kD處出現一條明顯的蛋白條帶(見圖4A)

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 王松;許誠;張紅梅;劉勇軍;劉威龍;徐六妹;譚艷;謝靖婧;陳心春;;RT-PCR檢測手足口病病原體EV71[J];中華實驗和臨床感染病雜志(電子版);2008年04期

2 劉寶芳;李玉杰;顧偉玲;王霞;;980例手足口病臨床分析[J];中華實驗和臨床感染病雜志(電子版);2009年03期

本文編號：2787652