【摘要】： 目的：本實驗通過制備新生大鼠重度缺氧缺血性腦損傷(HIBD)合并心肌損傷的模型,留取心肌組織,檢測其中CT-1mRNA的表達和相關凋亡基因的水平變化,及其與心肌細胞凋亡率的關系,探討重度HIBD合并心肌損傷的發(fā)病機制,為臨床治療提供新的思路。 方法：1.制備重度HIBD合并心肌損傷模型：新生7日齡wistar大鼠64只,隨機分為對照組8只,實驗組56只。實驗組雙側結扎并剪斷左頸總動脈后,低氧處理2.5小時,觀察缺氧時的行為變化。依不同時間點處死,觀察結扎左側腦皮層大體病理變化并取腦切片行TTC染色觀察病理變化。觀察心臟大體病理變化并取心臟切片行HE染色觀察病理變化。 2.取大鼠心肌組織,應用western blot法檢測心肌組織中CT-1mRNA及表達水平在缺氧后不同時間點的變化。 3.取大鼠心肌組織,應用PCR技術檢測心肌細胞中凋亡基因Bcl-2和bax、fas、Caspasse-3水平在缺氧后不同時間點的變化。 4.取大鼠心肌組織,應用TUNEL法檢測心肌細胞凋亡指數(shù)在缺氧后不同時間點的變化及其與CT-1、凋亡基因的相關性。 結果：1.HIBD組與對照組的比較HIBD組大鼠置于缺氧環(huán)境后先是躁動不安,然后不愛活動、倦怠,并出現(xiàn)不同程度的缺氧癥狀,如皮膚發(fā)紺、呼吸急促,還出現(xiàn)抽搐、大小便失禁,走路不穩(wěn),向左側旋轉。HIBD組大鼠左側半球腦組織受損較嚴重,蒼白、水腫明顯,并可看到結扎側半球局部出現(xiàn)液化壞死灶,TTC染色可見右側半腦組織呈深紅色,左側半腦組織呈蒼白色。HIBD組心肌收縮無力,心率快而不易數(shù)清,節(jié)律欠規(guī)整,心肌呈暗紅色。HE染色見心肌細胞腫脹,間質水腫,肌間隙增寬,心肌細胞排列紊亂,可見肌絲斷裂,出現(xiàn)肌溶解。 2. HIBD組與對照組相比,心肌細胞中CT-1mRNA水平及表達在缺血缺氧后2小時開始增加(P0.05),至48小時達到高峰,顯著高于對照組(P0.001),CT-1mRNA水平在72小時、5天開始下降,與對照組相比其差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),7天后低于對照組水平(P0.01)。其表達在72小時開始下降,但仍然顯著高于對照組(P0.001),5天、7天繼續(xù)降低,與對照組相比其差異已無統(tǒng)計學意義(P0.05)。二者成正相關(r=0.836,P0.001)。 3. HIBD組與對照組相比,促凋亡基因bax、fas、Caspase-3在缺血缺氧后2小時開始增加,bax、Caspase-3在48小時達到高峰,fas在72小時達到高峰,均顯著高于對照組(P0.001), bax、Caspase-3在72小時開始下降,但仍然顯著高于對照組(P0.001),7天時與對照組相比其差異已無統(tǒng)計學意義(P0.05)。fas在5天、7天開始下降,但仍然顯著高于對照組(P0.001)。抑凋亡基因Bcl-2在心肌細胞中的水平在缺血缺氧后2小時開始顯著降低(P0.001),至48小時降至最低,均顯著低于對照組(P0.001),72小時開始升高(P0.001),5天、7天繼續(xù)升高,但仍低于對照組(P0.005)。Bcl-2/bax二者比值也有同樣的變化趨勢,只是7天與對照組相比其差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。相關性分析結果顯示CT-1mRNA及表達與bax、fas、Caspase-3水平呈正相關(P0.05)；與bcl-2水平、bcl-2/bax比值呈負相關(P0.001)。 4. HIBD組與對照組相比心肌細胞凋亡指數(shù)在缺血缺氧后2小時開始增加(P0.01),72小時達到高峰,均顯著高于對照組(P0.001),5天、7天開始下降,仍顯著高于對照組(P0.005)。相關分析結果心肌細胞AI與CT-1mRNA水平、CT-1mRNA表達、bax、fas、Caspase-3水平呈正相關(P0.01)；與bcl-2水平、bcl-2/bax比值呈負相關(P0.001) 結論1.通過觀察大鼠一般情況、行為能力、腦組織大體形態(tài)、TTC染色,證實成功制備了重度HIBD新生大鼠動物模型。通過觀察新生大鼠缺氧后表現(xiàn)、心臟大體形態(tài)、心肌細胞HE染色,證實該模型符合缺氧缺血性心肌損傷模型。 2.重度HIBD大鼠心肌細胞CT-1mRNA及其表達在缺氧后迅速升高,說明CT-1參與了HIBD合并的心肌損傷的發(fā)病過程。提示CT-1可用于心肌細胞損害的診斷。 3.重度HIBD大鼠心肌細胞促凋亡基因bax、fas、Caspase-3在缺氧后迅速升高,抑凋亡基因Bcl-2則呈下降趨勢,凋亡指數(shù)升高,說明重度HIBD大鼠心肌細胞存在凋亡,重度HIBD大鼠合并有心肌損傷。 4. CT-1mRNA及其表達與心肌細胞凋亡基因、凋亡指數(shù)均存在良好的相關性,說明其可以通過參與心肌細胞凋亡的過程而在重度HIBD合并心肌損傷的發(fā)病過程中發(fā)揮重要的病理生理作用,為臨床治療提供新的思路。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R722.12
【圖文】：

結果H舊D合并心肌損傷動物模型實驗前大鼠較安靜。呼吸頻率波動在104一124次/min，平均112次/m組大鼠置于缺氧環(huán)境5分鐘后開始躁動不安，呼吸頻率加快，10分不愛活動，開始倦怠，均趴伏于容器的一角，出現(xiàn)了不同程度的缺氧如皮膚發(fā)組、呼吸急促、抽搐、大小便失禁等，并出現(xiàn)走路不穩(wěn)，向肢體抖動(見圖l)。IBD組大鼠左側半球腦組織受損較嚴重，在24h時蒼白、水腫明顯，于對側，72h可看到結扎側半球局部出現(xiàn)液化壞死灶。TTC組化染色傷常用的神經(jīng)病理學方法。在正常腦組織，線粒體氧化酶氧化TTC，使腦實質紅染。缺血延長使線粒體酶功能障礙，不能氧化TTC，白色。TTC染色可見右側半腦組織呈深紅色，左側半腦組織呈蒼白大鼠大腦半球左右對稱，未見任何病理變化(見圖2)。

使腦實質紅染。缺血延長使線粒體酶功能障礙，不能氧化TTC，導致腦呈蒼白色。TTC染色可見右側半腦組織呈深紅色，左側半腦組織呈蒼白色。對照組大鼠大腦半球左右對稱，未見任何病理變化(見圖2)。圖1夾尾左旋圖2腦組織標本TTC染色1.3.對照組大鼠心臟搏動有力，心肌呈鮮紅色，節(jié)律規(guī)整。HIBD組心肌收縮無力，心率快而不易數(shù)清，節(jié)律欠規(guī)整，心肌呈暗紅色。1.4對照組大鼠心肌細胞胞核呈藍色，胞漿及其他組織粉紅色，排列規(guī)則，輪廓清晰，核膜、核仁均可見，H工BD組心肌細胞腫脹，間質水腫，肌間隙增寬，心肌細胞排列紊亂，可見肌絲斷裂，出現(xiàn)肌溶解，肌細胞崩解，肌肉結構喪失(見圖3及圖4)。

5S圖5心肌組織總RNA瓊脂糖凝膠凝膠電泳結果如圖5所示，所提取的總RNA在1.0%的瓊脂糖凝膠凝膠中電泳，可以看到清晰的285和185兩個條帶，濃度較高，位置正確，其光密度的比值約為2:1左右，說明提取的總RNA完整性好，基本無降解�？俁NA在紫外分光光度儀上檢測，其OD260/28。均介于 1.8一2.0之間，表明總RNA純度好

【參考文獻】

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本文編號：2784682