【摘要】： 目的：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備新生大鼠重度缺氧缺血性腦損傷(HIBD)合并心肌損傷的模型,留取心肌組織,檢測(cè)其中CT-1mRNA的表達(dá)和相關(guān)凋亡基因的水平變化,及其與心肌細(xì)胞凋亡率的關(guān)系,探討重度HIBD合并心肌損傷的發(fā)病機(jī)制,為臨床治療提供新的思路。 方法：1.制備重度HIBD合并心肌損傷模型：新生7日齡wistar大鼠64只,隨機(jī)分為對(duì)照組8只,實(shí)驗(yàn)組56只。實(shí)驗(yàn)組雙側(cè)結(jié)扎并剪斷左頸總動(dòng)脈后,低氧處理2.5小時(shí),觀察缺氧時(shí)的行為變化。依不同時(shí)間點(diǎn)處死,觀察結(jié)扎左側(cè)腦皮層大體病理變化并取腦切片行TTC染色觀察病理變化。觀察心臟大體病理變化并取心臟切片行HE染色觀察病理變化。 2.取大鼠心肌組織,應(yīng)用western blot法檢測(cè)心肌組織中CT-1mRNA及表達(dá)水平在缺氧后不同時(shí)間點(diǎn)的變化。 3.取大鼠心肌組織,應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞中凋亡基因Bcl-2和bax、fas、Caspasse-3水平在缺氧后不同時(shí)間點(diǎn)的變化。 4.取大鼠心肌組織,應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)在缺氧后不同時(shí)間點(diǎn)的變化及其與CT-1、凋亡基因的相關(guān)性。 結(jié)果：1.HIBD組與對(duì)照組的比較HIBD組大鼠置于缺氧環(huán)境后先是躁動(dòng)不安,然后不愛(ài)活動(dòng)、倦怠,并出現(xiàn)不同程度的缺氧癥狀,如皮膚發(fā)紺、呼吸急促,還出現(xiàn)抽搐、大小便失禁,走路不穩(wěn),向左側(cè)旋轉(zhuǎn)。HIBD組大鼠左側(cè)半球腦組織受損較嚴(yán)重,蒼白、水腫明顯,并可看到結(jié)扎側(cè)半球局部出現(xiàn)液化壞死灶,TTC染色可見(jiàn)右側(cè)半腦組織呈深紅色,左側(cè)半腦組織呈蒼白色。HIBD組心肌收縮無(wú)力,心率快而不易數(shù)清,節(jié)律欠規(guī)整,心肌呈暗紅色。HE染色見(jiàn)心肌細(xì)胞腫脹,間質(zhì)水腫,肌間隙增寬,心肌細(xì)胞排列紊亂,可見(jiàn)肌絲斷裂,出現(xiàn)肌溶解。 2. HIBD組與對(duì)照組相比,心肌細(xì)胞中CT-1mRNA水平及表達(dá)在缺血缺氧后2小時(shí)開(kāi)始增加(P0.05),至48小時(shí)達(dá)到高峰,顯著高于對(duì)照組(P0.001),CT-1mRNA水平在72小時(shí)、5天開(kāi)始下降,與對(duì)照組相比其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),7天后低于對(duì)照組水平(P0.01)。其表達(dá)在72小時(shí)開(kāi)始下降,但仍然顯著高于對(duì)照組(P0.001),5天、7天繼續(xù)降低,與對(duì)照組相比其差異已無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。二者成正相關(guān)(r=0.836,P0.001)。 3. HIBD組與對(duì)照組相比,促凋亡基因bax、fas、Caspase-3在缺血缺氧后2小時(shí)開(kāi)始增加,bax、Caspase-3在48小時(shí)達(dá)到高峰,fas在72小時(shí)達(dá)到高峰,均顯著高于對(duì)照組(P0.001), bax、Caspase-3在72小時(shí)開(kāi)始下降,但仍然顯著高于對(duì)照組(P0.001),7天時(shí)與對(duì)照組相比其差異已無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。fas在5天、7天開(kāi)始下降,但仍然顯著高于對(duì)照組(P0.001)。抑凋亡基因Bcl-2在心肌細(xì)胞中的水平在缺血缺氧后2小時(shí)開(kāi)始顯著降低(P0.001),至48小時(shí)降至最低,均顯著低于對(duì)照組(P0.001),72小時(shí)開(kāi)始升高(P0.001),5天、7天繼續(xù)升高,但仍低于對(duì)照組(P0.005)。Bcl-2/bax二者比值也有同樣的變化趨勢(shì),只是7天與對(duì)照組相比其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示CT-1mRNA及表達(dá)與bax、fas、Caspase-3水平呈正相關(guān)(P0.05)；與bcl-2水平、bcl-2/bax比值呈負(fù)相關(guān)(P0.001)。 4. HIBD組與對(duì)照組相比心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)在缺血缺氧后2小時(shí)開(kāi)始增加(P0.01),72小時(shí)達(dá)到高峰,均顯著高于對(duì)照組(P0.001),5天、7天開(kāi)始下降,仍顯著高于對(duì)照組(P0.005)。相關(guān)分析結(jié)果心肌細(xì)胞AI與CT-1mRNA水平、CT-1mRNA表達(dá)、bax、fas、Caspase-3水平呈正相關(guān)(P0.01)；與bcl-2水平、bcl-2/bax比值呈負(fù)相關(guān)(P0.001) 結(jié)論1.通過(guò)觀察大鼠一般情況、行為能力、腦組織大體形態(tài)、TTC染色,證實(shí)成功制備了重度HIBD新生大鼠動(dòng)物模型。通過(guò)觀察新生大鼠缺氧后表現(xiàn)、心臟大體形態(tài)、心肌細(xì)胞HE染色,證實(shí)該模型符合缺氧缺血性心肌損傷模型。 2.重度HIBD大鼠心肌細(xì)胞CT-1mRNA及其表達(dá)在缺氧后迅速升高,說(shuō)明CT-1參與了HIBD合并的心肌損傷的發(fā)病過(guò)程。提示CT-1可用于心肌細(xì)胞損害的診斷。 3.重度HIBD大鼠心肌細(xì)胞促凋亡基因bax、fas、Caspase-3在缺氧后迅速升高,抑凋亡基因Bcl-2則呈下降趨勢(shì),凋亡指數(shù)升高,說(shuō)明重度HIBD大鼠心肌細(xì)胞存在凋亡,重度HIBD大鼠合并有心肌損傷。 4. CT-1mRNA及其表達(dá)與心肌細(xì)胞凋亡基因、凋亡指數(shù)均存在良好的相關(guān)性,說(shuō)明其可以通過(guò)參與心肌細(xì)胞凋亡的過(guò)程而在重度HIBD合并心肌損傷的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要的病理生理作用,為臨床治療提供新的思路。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R722.12
【圖文】：

結(jié)果H舊D合并心肌損傷動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)前大鼠較安靜。呼吸頻率波動(dòng)在104一124次/min，平均112次/m組大鼠置于缺氧環(huán)境5分鐘后開(kāi)始躁動(dòng)不安，呼吸頻率加快，10分不愛(ài)活動(dòng)，開(kāi)始倦怠，均趴伏于容器的一角，出現(xiàn)了不同程度的缺氧如皮膚發(fā)組、呼吸急促、抽搐、大小便失禁等，并出現(xiàn)走路不穩(wěn)，向肢體抖動(dòng)(見(jiàn)圖l)。IBD組大鼠左側(cè)半球腦組織受損較嚴(yán)重，在24h時(shí)蒼白、水腫明顯，于對(duì)側(cè)，72h可看到結(jié)扎側(cè)半球局部出現(xiàn)液化壞死灶。TTC組化染色傷常用的神經(jīng)病理學(xué)方法。在正常腦組織，線粒體氧化酶氧化TTC，使腦實(shí)質(zhì)紅染。缺血延長(zhǎng)使線粒體酶功能障礙，不能氧化TTC，白色。TTC染色可見(jiàn)右側(cè)半腦組織呈深紅色，左側(cè)半腦組織呈蒼白大鼠大腦半球左右對(duì)稱，未見(jiàn)任何病理變化(見(jiàn)圖2)。

使腦實(shí)質(zhì)紅染。缺血延長(zhǎng)使線粒體酶功能障礙，不能氧化TTC，導(dǎo)致腦呈蒼白色。TTC染色可見(jiàn)右側(cè)半腦組織呈深紅色，左側(cè)半腦組織呈蒼白色。對(duì)照組大鼠大腦半球左右對(duì)稱，未見(jiàn)任何病理變化(見(jiàn)圖2)。圖1夾尾左旋圖2腦組織標(biāo)本TTC染色1.3.對(duì)照組大鼠心臟搏動(dòng)有力，心肌呈鮮紅色，節(jié)律規(guī)整。HIBD組心肌收縮無(wú)力，心率快而不易數(shù)清，節(jié)律欠規(guī)整，心肌呈暗紅色。1.4對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞胞核呈藍(lán)色，胞漿及其他組織粉紅色，排列規(guī)則，輪廓清晰，核膜、核仁均可見(jiàn)，H工BD組心肌細(xì)胞腫脹，間質(zhì)水腫，肌間隙增寬，心肌細(xì)胞排列紊亂，可見(jiàn)肌絲斷裂，出現(xiàn)肌溶解，肌細(xì)胞崩解，肌肉結(jié)構(gòu)喪失(見(jiàn)圖3及圖4)。

5S圖5心肌組織總RNA瓊脂糖凝膠凝膠電泳結(jié)果如圖5所示，所提取的總RNA在1.0%的瓊脂糖凝膠凝膠中電泳，可以看到清晰的285和185兩個(gè)條帶，濃度較高，位置正確，其光密度的比值約為2:1左右，說(shuō)明提取的總RNA完整性好，基本無(wú)降解�？俁NA在紫外分光光度儀上檢測(cè)，其OD260/28。均介于 1.8一2.0之間，表明總RNA純度好

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2784682