【摘要】：研究目的: 研究CD4~+CD25~+Foxp3~+調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)、效應(yīng)性Th17細胞(Th17)、樹突狀細胞(DC)及Toll樣受體(TLR)在膽道閉鎖(BA)患兒免疫炎癥發(fā)展中的作用;并通過小鼠模型,觀察通過注射IL-6中和抗體抑制Th17細胞分化對膽道閉鎖發(fā)病的影響。 研究方法: 收集32例膽道閉鎖和18例對照組患兒(非膽道疾病)肝臟和外周血標本。實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(Q-RT-PCR)及免疫組織化學(xué)方法檢測肝臟組織Foxp3、IL-17、ROR-γt的mRNA及蛋白表達;流式細胞術(shù)檢測外周血CD4~+CD25~+Foxp3~+T細胞和Th17細胞占CD4~+T細胞比例;ELISA法檢測血清中相關(guān)細胞因子IL-10、TGF-β、IL-17、IL-6、IFN-γ、IL-12的表達;分離外周血樹突狀細胞(DC),CD4~+T和CD8+T細胞,ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清IL-6的表達變化;將T淋巴細胞和DC細胞混合培養(yǎng),ELISA法檢測培養(yǎng)上清中IL-17的表達;Q-RT-PCR,Western blot及免疫熒光檢測DC細胞TLR3、7、8 mRNA及蛋白的表達。應(yīng)用恒河猴輪狀病毒(RRV)建立膽道閉鎖小鼠模型,將新生Balb/c鼠隨機分為正常對照組,病毒對照組和IL-6抗體組,正常對照組腹腔注射病毒培養(yǎng)液,即含2%胎牛血清的最低必須培養(yǎng)基(2% Fetal Cow Serum - Minimum Essential Medium,2%FCS-MEM),病毒對照組腹腔注射RRV,IL-6抗體組在腹腔注射RRV之后的24小時按注射劑量分4組注射IL-6中和抗體,分別為5μg,15μg,20μg,25μg,觀察小鼠的臨床表現(xiàn)及其組織病理學(xué)變化。應(yīng)用實時定量熒光PCR (Q-RT-PCR)分別檢測正常對照組,病毒對照組,IL-6抗體組小鼠出生4、7、10、14、21天肝臟Foxp3,IL-17,ROR-γt mRNA的表達;分離脾臟樹突狀細胞(DC),CD4+T和CD8+T細胞,ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清IL-6的表達變化;將T淋巴細胞和DC細胞混合培養(yǎng),ELISA法檢測培養(yǎng)上清中IL-17的表達;Q-RT-PCR檢測DC細胞TLR3、7、8 mRNA的表達。 實驗結(jié)果: 免疫組織化學(xué)顯示BA組肝組織匯管區(qū)Treg和Th17細胞明顯比對照組增多,肝臟Foxp3、ROR-γt,IL-17的mRNA及蛋白表達量也顯著高于對照組患兒,P0.05。BA組中血清TGF-β、IL-10(Treg相關(guān)因子)、IL-17(Th17相關(guān)因子)、IL-12、IFN-γ(Th1相關(guān)因子)和IL-6均顯著高于對照組,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其中IL-6升高24倍,最為明顯。流式細胞學(xué)檢查顯示外周血Th17/CD4~+T比例顯著高于對照組,P0.05;Treg/CD4+T細胞比例無差異;而同一患者中Treg/Th17比例顯著低于對照組,P0.05。體外細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)BA組DC細胞培養(yǎng)上清的IL-6明顯增高;BA組PMBC+DC細胞+ TGF-β培養(yǎng)上清中IL-17表達增高(P0.05);DC細胞TLR3、7、8的表達顯著高于對照組,P0.05。94只病毒對照組小鼠中64只小鼠發(fā)生BA (71.91%),出現(xiàn)發(fā)育遲緩(表現(xiàn)為體重增加緩慢、停滯)和膽汁淤積(表現(xiàn)為無毛區(qū)黃疸、尿色深黃、陶土樣大便)癥狀。肝臟大體觀可見明顯黃染,表面呈顆粒狀,肝外膽管呈索條狀閉鎖,膽囊顯示不清,組織切片蘇木素伊紅染色(Hematoxylin-Eosin stain, HE)顯示肝內(nèi)外膽管閉鎖;其中壽命達到或超過21d的小鼠僅4只(包括21天取材2只),比例為6.25%;無小鼠退黃(0%);193只IL-6抗體組小鼠中,5μg、15μg、20μg注射劑量組各48只,分別有34只(73.91%)、33只(70.21%)、29只(61.71%)出現(xiàn)上述表現(xiàn),25μg注射劑量組49只,有25只(52.08%)小鼠出現(xiàn)上述表現(xiàn),顯著低于病毒對照組,P0.05;壽命超過或達到21d的BA小鼠2只,比例為9.52%;4只小鼠自然退黃,體重逐漸恢復(fù),比例為16%,顯著高于病毒對照組,P0.01;31只對照組小鼠觀察至21天沒有上述表現(xiàn)。病毒對照組小鼠肝組織內(nèi)Foxp3,IL-17,ROR-γt mRNA表達在第7-10天顯著高于正常組和25ug劑量的IL-6抗體組,P0.05。體外細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)病毒對照組小鼠DC細胞培養(yǎng)上清的IL-6明顯增高,P0.05;病毒對照組小鼠T細胞+DC細胞+ TGF-β培養(yǎng)上清中IL-17表達增高,P0.05;DC細胞TLR3、7、8的表達顯著高于對照組,P0.05。 實驗結(jié)論: 1. BA患兒中Th17細胞增多、IL-17水平增高而Treg細胞相對減少在BA的進行性免疫炎癥中發(fā)揮重要作用。 2. BA中DC細胞通過TLRs識別病原微生物而活化,分泌大量IL-6,促進Th17細胞分化,而抑制Treg細胞分化,從而導(dǎo)致BA體內(nèi)呈現(xiàn)過度免疫。 3.通過IL-6抗體抑制Th17細胞分化,可以達到降低BA發(fā)病率、延長BA患兒生存時間的目的。為治療BA的進行性免疫炎癥奠定了實驗基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R726.5
【圖文】：

20圖 1 肝臟組織中 Foxp3、IL-17、ROR-γt 的免疫組織化學(xué)染色（200×）：A、C、BA 組 Foxp3、IL-17、ROR-γt 表達；B、D、F：C 組 Foxp3、IL-17、ROR-γt 的表

外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg和Th17細胞流式檢測圖

2. BA組中DC細胞培養(yǎng)上清液中IL-6表達升高:第一部分中結(jié)果顯示 BA 組血清中 IL-6 水平是對照組的 24 倍，分離培養(yǎng)外周血免疫細胞，選取 BA 肝臟匯管區(qū)顯著增多的 CD4+、CD8+、DC 細胞進行體外培養(yǎng)。結(jié)果顯示與對照組相比 DC 細胞培養(yǎng)上清中 IL-6 的表達上調(diào)最明顯，P<0.001；而 CD4+T和 CD8+T 細胞的培養(yǎng)上清中，IL-6 的表達與對照組無顯著差異 P>0.05（圖 2）。圖 1 免疫熒光染色顯示成熟的 DCs 表達共刺激分子 CD80、CD86：上圖藍色為細胞核染色，紅色為 CD80 染色，綠色為 CD86 染色，黃色為 CD80、CD86。其中雙標陽性染色的細胞比例>85%。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 湯紹濤;膽道閉鎖與細胞因子[J];中華小兒外科雜志;2003年01期

2 馬亞貞;湯紹濤;童強松;王勇;毛永忠;李時望;董寧;阮慶蘭;;輪狀病毒致膽道閉鎖動物模型的建立[J];中華小兒外科雜志;2007年12期

本文編號：2779984