【摘要】： 目的：觀察柯薩奇B3病毒(Coxsackie virus B3，CVB3)對大鼠心肌成纖維細胞增殖和骨橋蛋白(osteopontin，OPN)表達的影響，探討OPN在病毒性心肌炎的可能作用機制。 方法：取出生3～7天的SD大鼠心臟，改良法原代培養(yǎng)心肌成纖維細胞，利用細胞形態(tài)及細胞免疫化學染色對細胞進行鑒定；分別用不同滴度的CVB3感染心肌成纖維細胞，采用MTT法檢測其OD值，用RT-PCR和Western-Blot檢測OPN mRNA和蛋白的表達。 結(jié)果： 1．用胰酶與膠原酶合用消化分離心肌成纖維細胞，可提高心肌成纖維細胞的存活率，心肌成纖維細胞抗波形蛋白(vimentin)染色陽性，抗α-橫紋肌肌動蛋白(α-sarcomeric actin)染色陰性。 2．用MOI分別為0、0.2PFU/cell、0.5PFU/cell、1.0PFU/cell的CVB3感染心肌成纖維細胞，MTT測得其OD值分別為0.35±0.05、0.37±0.04、0.66±0.07、0.32±0.07，MOI為0.5PFU/cell組OD值高于對照組、0.2PFU/cell組及1.0PFU/cell組，差異有顯著性(P＜0.05)。 3．用MOI為0.5PFU/cell的CVB3感染心肌成纖維細胞，用MTT測得對照組12h、病毒組12h、1d、2d、3d的OD值分別為0.36±0.06、0.47±0.06、0.56±0.04、0.72±0.04、0.64±0.02，病毒感染12h其OD值即增高，第2d達高峰，于第3d開始有下降趨勢，各組比較差異均有顯著性(P＜0.05)。 4．用RT-PCR測得心肌成纖維細胞對照組12h、1d、2d、3dOPN/β-actin光密度比值分別為0.38±0.06、0.35±0.02、0.41±0.07、0.30±0.06，各組比較差異無顯著性(P＞0.05)；病毒組12h、1d、2d、3d OPN/β-actin光密度比值分別為0.56±0.06、0.72±0.05、0.98±0.06、0.86±0.02，病毒感染12h其光密度值即增高，第2d達高峰，于第3d開始有下降趨勢，各組比較差異均有顯著性(P＜0.05)。 5．用Western-Blot測得心肌成纖維細胞對照組12h、病毒組12h、1d、2d、3d OPN/β-actin灰度值分別為0.26±0.04、0.36±0.03、0.52±0.06、0.76±0.06、0.62±0.03，病毒感染12h其灰度值即增高，第2d達高峰，于第3d開始有下降趨勢，各組比較差異均有顯著性(P＜0.05)。 6．將RT-PCR OPN/β-actin光密度值及Western-Blot OPN/β-actin與MTT(OD)值進行相關(guān)分析，Pearson相關(guān)系數(shù)分別為r=0.951，P=0.000及r=0.954，P=0.000，二者呈正相關(guān)關(guān)系。 結(jié)論： 1．一定滴度的CVB3可誘導心肌成纖維細胞增殖。 2．CVB3可使心肌成纖維細胞增殖及OPN表達增加，在一定時間內(nèi)呈時間依賴性。 3．OPN表達與心肌成纖維細胞增殖呈正相關(guān)，提示OPN可能通過與心肌成纖維細胞增殖互為因果，共同參與病毒性心肌炎的發(fā)病機制。
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R725.4
【圖文】：

開始統(tǒng)計。細胞病變表示法:“一”無細胞病變，“+”<25%的細胞有病變，“料”25%一50%的細胞有病變，“+十十”50%一75%的細胞有病變，“十+++”75%以上的細胞有病變。以細胞CP少50%記為病變孔(見圖3一3，表3一l)。圖3一 3CvB3在H。la細胞上擴增時細胞形態(tài)改變a:正常Hela細胞 (x100):b:發(fā)生CPE的Hela細胞，細胞變圓變暗，漂浮成葡萄串樣聚集 (x100)表3一ICVB3感染Hela細胞TCID50的測定結(jié)果(Reed-Mneneh法)病毒稀釋度細胞CPE觀察累計CPE總計細胞孔總數(shù)出現(xiàn)CPE陽性率(%)陽性孔陰性孔陽性孔陰性孔 4025025100(25/25)2l1721l7100(21/2l)10()(17門7)OnU100(13/13)100(9/9)100(5/5) 04077(l/4)(0/7) 4444410-10-2護丫0-s滬o-s0-v參照Reed一Mnench公式，距離比例 =(CPE陽性率高于50%的百分數(shù)一50)/ (CPE陽性率高于50%的百分數(shù)一CPE陽性率低于50%的百分數(shù))。半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(TCID50)的對數(shù)=大于50%的陽性百分比的最高稀釋度對數(shù)+距離比例x稀釋度間距的對數(shù)，查反對數(shù)表即可得到數(shù)值。由上表知evB3的TCIns。介于10一6一10一7之間。根據(jù)Reed一靦eneh法計算

預(yù)心肌成纖維細胞24小時，MTT結(jié)果顯示，Mol為0.SPFU/cell時，可促進細胞增殖，其OD值明顯高于MOI為0(對照組)、 0.2PFU/cell及 1.0PFU/cell組，差異均有顯著性(尸<0.05)(見表3一2，圖3一)。表3一2不同滴度CvB3誘導心肌成纖維細胞增殖MTT值(叉土，刀=12)CVB3濃度(MOI，PFU/eell)M罰，(0D值)0.35士0.050.37士0.040.66士0.07a0一32士0.07方差分析&N尺勺檢驗Mrl，(OD)值比較:介78.594，尸{.000，“與對照組、MOI為0.2PFU/ee】l、MOI為 1.OPFU/ccll組比較，差異均有顯著性，尸<0.05

本文編號：2775772