本文關(guān)鍵詞：嬰幼兒隱匿性乙型肝炎病毒感染的分子生物學(xué)特征分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染是危害人類健康的重大傳染病之一。據(jù)統(tǒng)計全球約有20億人曾感染過HBV,其中慢性HBV感染者約為3.5億人,估計每年約有100萬人死于因HBV感染所導(dǎo)致的相關(guān)疾病,如肝硬化、肝衰竭和原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)。我國是HBV感染的高流行地區(qū),HBV攜帶者達(dá)9300萬人,其中慢性乙肝患者達(dá)2500萬,成為我國最為重要的三大傳染病之一,也是引起HCC主要原因。近十年來,隱匿性乙型肝炎病毒感染(Occult hepatitis B virus infection, OBI)廣泛受到輸血醫(yī)學(xué)及臨床工作者的重視。定義為表面抗原檢測陰性,而血清或肝臟組織中HBV DNA檢測為陽性,實為乙型肝炎病毒(HBV)的一種潛伏性感染形式,而且是輸血、器官移植、血液透析傳播乙肝病毒的重要原因。我國慢性乙型肝炎感染主要是由圍生期母嬰傳播導(dǎo)致,由于新生兒免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟,容易導(dǎo)致免疫耐受而產(chǎn)生慢性感染,隨著年齡增長發(fā)展為肝硬化、肝癌的幾率也顯著升高。不但在輸血傳播疾病中OBI廣泛受到關(guān)注,自2008年以來越來越多的各國研究人員開始關(guān)注母嬰傳播OBI的分子免疫機(jī)制。OBI可發(fā)生于乙型肝炎表面抗體／乙型肝炎核心抗體(anti-HBs/anti-HBc)陽性人群,也可發(fā)生于anti-HBs/anti-HBc陰性人群中,其檢測結(jié)果主要依賴于檢測乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B virus antigen,HBsAg)和HBV DNA試劑的靈敏度。研究表明,OBI形成最常見的原因是HBV基因變異尤其是S區(qū)及前S區(qū)變異,可影響HBV蛋白的表達(dá),導(dǎo)致HBsAg陰性,或者引起抗原表位構(gòu)相變化,影響抗原抗體反應(yīng),導(dǎo)致試劑難以檢測。導(dǎo)致OBI的其他原因還包括HBV其他結(jié)構(gòu)區(qū)域變異,如X區(qū)變異,前C和C區(qū)變異等；另外,HBsAg分泌障礙導(dǎo)致大量HBsAg滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不能分泌到胞外,從而導(dǎo)致HBsAg陰性的假象。再次,其他病毒感染的干擾,如HBV與其他嗜肝性病毒或者HIV重疊感染,也可相互影響導(dǎo)致HBV復(fù)制受到限制呈現(xiàn)出HBsAg陰性的感染狀態(tài)。在Pre-s/s區(qū)的任一突變都可以導(dǎo)致改變HBsAg的抗原性并且會抑制anti-HBs的產(chǎn)生。該區(qū)域的第124到147氨基酸序列包含“a”決定簇和包含應(yīng)答anti-HBs顯性B細(xì)胞抗原簇。一個氨基酸在這個區(qū)域的替換突變就會間接破壞anti-HBs的循環(huán)產(chǎn)生,導(dǎo)致人群在接種乙肝疫苗后發(fā)生變異性感染,或者發(fā)生OBI。在急性乙型肝炎發(fā)生早期,HBV可自由地以免疫復(fù)合物形式存在。隨后,在HBsAg轉(zhuǎn)向anti-HBs后就轉(zhuǎn)化為免疫復(fù)合物為主,這表明血清中的HBV DNA與anti-HBs形成免疫復(fù)合物也會致使OBI的發(fā)生和發(fā)展。研究目的：本研究通過對HBsAg陽性孕婦生產(chǎn)的嬰幼兒進(jìn)行跟蹤隨訪,以探究經(jīng)乙肝疫苗主被動免疫和高效價乙肝免疫球蛋白(Hepatitis B immunoglobulin, HBIG)被動免疫以后,嬰幼兒乙型肝炎與隱匿性乙型肝炎感染的發(fā)生率及其分子免疫特征,進(jìn)而為乙肝或OBI的預(yù)防、臨床發(fā)生發(fā)展和個性化治療方案提供理論指導(dǎo)。研究方法：本研究采集乙肝表面抗原陽性的母親及其分娩的嬰幼兒出生至少3個月以上后的血漿樣本,并在48個月內(nèi)進(jìn)行隨訪,第二次采集血液樣品。嬰幼兒樣本在南方醫(yī)院肝病中心使用美國雅培公司試劑盒采用化學(xué)發(fā)光法(CMIA)進(jìn)行HBsAg定量( 0.05IU/ml為陰性),anti-HBs的定量 ( 10mIU/ml為陰性),HBeAg (S/CO值1為陰性)的檢測。在廈門大學(xué)國家傳染病診斷試劑與疫苗技術(shù)工程研究中心(NIDVD)采用EIA進(jìn)行全部樣品的anti-HBc的定量檢測,核酸標(biāo)準(zhǔn)品來自于英國NIBSC。應(yīng)用廣州達(dá)瑞公司乙型肝炎病毒e抗原時間分辨免疫熒光試劑盒對母親樣本進(jìn)行HBeAg的定量。采用羅氏公司高純度核酸提取試劑盒提取血清HBV DNA核酸,根據(jù)文獻(xiàn),采用高靈敏度的巢式PCR和QPCR等的方法進(jìn)行HBV PreS/S、S區(qū)和BCP/PC區(qū)的擴(kuò)增,擴(kuò)增使用的Taq酶為Takara公司的rTaq和La-Taq酶。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)羅氏公司切膠純化回收試劑盒回收后送立菲公司進(jìn)行Sanger測序,測序儀器為A.B13730。獲得序列經(jīng)Seqman和MEGA6序列分析軟件進(jìn)行比對和進(jìn)化分析。從Genbank基因數(shù)據(jù)庫選取我國B型,C型和D型HBV野毒株全基因序列作為參考序列進(jìn)行比對分析。翻譯成蛋白質(zhì)進(jìn)行突變分析,系統(tǒng)進(jìn)化樹方法對所得樣本的基因型進(jìn)行分型。對于有疑問的樣本進(jìn)行T載體克隆并分析鑒定。應(yīng)用高靈敏度的實時熒光定量(QPCR)方法對嬰幼兒和母親樣本分別進(jìn)行HBV DNA定量,標(biāo)準(zhǔn)品來自于英國NIBSC,靈敏度可達(dá)5IU/ml。研究結(jié)果：1.目標(biāo)人群：本研究共納入77位嬰幼兒及兒童,年齡分布3-96個月,共采集到92份樣本,其中62位只有1次隨訪抽血,15位有2次隨訪抽血。并收集到62位HBsAg日性母親的68份血漿樣本,其中56位只有1次隨訪抽血,6位是進(jìn)行了2次隨訪抽血。同時還收集到6份HBsAg陽性母親的臍帶血樣品。納入的母親平均年齡28歲。本研究中涉及到的新生兒乙肝疫苗接種率為100%,疫苗接種時間為產(chǎn)后24小時之內(nèi),同時在與乙肝疫苗不同側(cè)臀部注射高效價乙肝免疫球蛋白(HBIG)進(jìn)行被動免疫。2.血清學(xué)指標(biāo)： (1)對嬰幼兒樣品檢測發(fā)現(xiàn),3.9%(3/77)HBsAg陽性患兒,其余均為HBsAg陰性； 11.7%(9/77)HBeAg陽性：2.6%(2/77)HBsAg陰性/HBeAg陽性/HBV DNA陰性；5.2%(4/77)HBsAg陰性/anti-HBs陰性/anti-HBc陰性。共有14.3%(11/77)anti-HBs水平大于1000mIU/ml,其中91%(10/11)都是在出生后6個月接種第三針乙肝疫苗以后檢測的,anti-HBs在小于6個月、6-12個月、大于12個月各年齡階段中位數(shù)分別為169.8 (57.9-289.7) mIU/ml,387.7 (152.3-1301.2) mIU/ml,142.2 (49.1-498.8) mIU/ml。共有80%(74/92)嬰幼兒樣本檢測anti-HBc陽性,從6個月以后anti-HBc水平顯著下降,18個月以后普遍降至為陰性。 (2)對母親樣本檢測發(fā)現(xiàn),40.3%(25/62) HBeAg陽性。 (3)對6例臍帶血檢測發(fā)現(xiàn),1例HBsAg為弱陽性,有3例HBeAg陽性,anti-HBc全部陽性。3. HBV DNA檢測： (1)在89份HBsAg陰性血漿樣本中(含59份初次采集樣品和15份第二次隨訪采集樣品),其中20份樣品擴(kuò)增出了BCP/PC片段,第2次隨訪樣本HBV DNA均為陰性,所有樣本Anti-HBs值均為陽性(10mIU/ml),同時有4份樣品的HBeAg值是陽性(1 S/CO)。共發(fā)現(xiàn)87處突變,其中3例發(fā)現(xiàn)A1762T/G1764A雙突變,8例發(fā)現(xiàn)了G1896A,但是這8例均為HBeAg陰性,同時還發(fā)現(xiàn)G1752A, A1846T, T1858C等處突變。(2) HBsAg陰性樣品中共有13份樣品擴(kuò)增出了S片段,同樣沒有第2次隨訪血液樣本,有8例同時擴(kuò)出了BCP/PC和S兩個片段。Anti-HBs值均為陽性(10mIU/ml), Anti-HBc也全部為陽性。其中3例HBeAg陽性。在S片段共發(fā)現(xiàn)8處氨基酸突變,分別為G45E、T139L、T47A、S53L、C76S、 Q101R, T125M和P127T,未發(fā)現(xiàn)重要的V39A、P41H、E64K、G145R突變。(3)92份樣本(上述89份樣品,再加3份初次隨訪HBsAg陽性樣品)中HBsAg陰性經(jīng)QPCR檢測后HBV DNA陽性(病毒載量,viral load,VL 5IU/ml)的樣品共有13例,Anti-HBs也均為陽性(10 mIU/ml),且HBeAg都為陰性(1 S/CO),有4例是BCP/PC,S和VL均為陽性,其中BCP/PC或者S陽性和VL陽性的有5例。(4)6例臍帶血中有1例巢式PCR擴(kuò)增S片段為陽性。 (4)S基因序列母嬰比對：對HBsAg陽性的3例嬰兒樣品進(jìn)行分析,樣品B75的S片段的與其母親的比較有4個堿基不一致,分別是357位,381位,480位,636位,導(dǎo)致4個氨基酸變異,分別為T68I, Y76C, Q109L,Y161F。而B74和B76與其母親的HBV S片段氨基酸完全一致。通過系統(tǒng)進(jìn)樹分析,13例HBV DNA S片段陽性樣品中B基因型10例,C基因型2例,D基因型1例。與12位母親獲得相應(yīng)的HBV S序列比對發(fā)現(xiàn),有6對母嬰序列高度一致并且基因型相同,但是另外6對母嬰HBV S序列與基因型不同。研究結(jié)論：對廣州市南方醫(yī)院(三甲級)HBV母嬰傳播調(diào)查顯示,母親為乙肝表面抗原陽性的新生兒出現(xiàn)HBsAg陽性的比率為3.9%(3/77),出現(xiàn)HBeAg陽性的比率為11.7%(9/77),出現(xiàn)HBV DNA陽性的比率為36.4%(28/77)。由于第2次48個月內(nèi)隨訪采集的血液樣本中未發(fā)現(xiàn)HBV DNA陽性樣品,因此本研究調(diào)查中所有的HBsAg陰性,HBV DNA陽性的嬰幼兒認(rèn)為是一過性O(shè)BI感染狀態(tài),未發(fā)現(xiàn)持續(xù)性O(shè)BI,根據(jù)OBI判定標(biāo)準(zhǔn),其中18.2%(14/77)確定為一過性O(shè)BI。在目前的醫(yī)療新生兒24小時內(nèi)聯(lián)合接種乙肝疫苗和HBIG并按計劃完成疫苗免疫可以有效阻斷96%以上HBV母嬰傳播。
【關(guān)鍵詞】：母嬰傳播 乙型肝炎病毒(HBV) 隱匿性乙型肝炎病毒感染(OBI) DNA序列
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R725.1
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-20
• 1 材料20-24
• 1.1 研究樣品20
• 1.2 主要試劑20-21
• 1.3 主要儀器21-22
• 1.4 主要溶液的配制22-23
• 1.5 引物設(shè)計23-24
• 2 方法24-36
• 2.1 血清學(xué)標(biāo)志物和病毒核酸的檢測24
• 2.2 樣品病毒核酸的提取24-26
• 2.3 樣品BCP/PC、PreC/C及PreS/S、S片段的巢式PCR擴(kuò)增26-30
• 2.4 PCR產(chǎn)物的凝膠回收30-31
• 2.5 乙肝病毒載量的測定(QPCR)31
• 2.6 HBV Pre-S/S,S PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定31-33
• 2.7 OBI樣品BCP/PC、PreC/C、Pre-S/S、S片段的基因序列測定33
• 2.8 選取HBV野毒株全基因參照序列33-34
• 2.9 OBI樣品與陽性母親樣品的基因分型34-35
• 2.10 OBI樣品與參照樣品的核苷酸/氨基酸序列差異的概念35
• 2.11 軟件35-36
• 3 結(jié)果36-61
• 3.1 納入研究對象的人口學(xué)特點36-37
• 3.2 HBV血清學(xué)標(biāo)志37-42
• 3.3 HBV DNA載量測定結(jié)果42-46
• 3.4 嬰幼兒血液樣品HBV BCP/PC片段擴(kuò)增46-50
• 3.5 S片段的擴(kuò)增50-53
• 3.6 嬰幼兒樣本HBV DNA序列與母源序列比較分析53-60
• 3.7 臍帶血BCP/PC片段和S片段的擴(kuò)增60-61
• 4 討論61-67
• 4.1 乙肝疫苗及免疫球蛋白的免疫預(yù)防的規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)61-62
• 4.2 血清學(xué)檢測結(jié)果分析62-64
• 4.3 嬰幼兒樣品HBV DNA定量檢測結(jié)果與確認(rèn)的分析64
• 4.4 嬰幼兒樣品BCP/PC擴(kuò)增片段的分析64-65
• 4.5 嬰幼兒樣品S擴(kuò)增片段的分析65-66
• 4.6 嬰幼兒HBV DNA擴(kuò)增序列與母源序列的比對分析66-67
• 5 全文總結(jié)67-68
• 參考文獻(xiàn)68-75
• 綜述75-83
• 參考文獻(xiàn)80-83
• 縮略詞83-84
• 附錄84-90
• 發(fā)表論文90-91
• 致謝91-93

【共引文獻(xiàn)】

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1 杜鵬;鄭欣;許曉絢;王鎮(zhèn);曾勁峰;王文敬;黎誠耀;葉賢林;;深圳地區(qū)無償獻(xiàn)血人群隱匿性乙型肝炎病毒感染血清學(xué)和分子生物學(xué)特征分析[J];中國輸血雜志;2014年05期

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1 陳平;實施乙型肝炎疫苗免疫20年后中國東南部海島地區(qū)乙肝血清和分子流行病學(xué)研究[D];浙江大學(xué);2013年

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1 趙曉燕;HBV隱匿性感染及其光化學(xué)滅活機(jī)制的研究[D];華東師范大學(xué);2013年

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本文編號：277547