本文關鍵詞：嬰幼兒隱匿性乙型肝炎病毒感染的分子生物學特征分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染是危害人類健康的重大傳染病之一。據統計全球約有20億人曾感染過HBV,其中慢性HBV感染者約為3.5億人,估計每年約有100萬人死于因HBV感染所導致的相關疾病,如肝硬化、肝衰竭和原發(fā)性肝細胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)。我國是HBV感染的高流行地區(qū),HBV攜帶者達9300萬人,其中慢性乙肝患者達2500萬,成為我國最為重要的三大傳染病之一,也是引起HCC主要原因。近十年來,隱匿性乙型肝炎病毒感染(Occult hepatitis B virus infection, OBI)廣泛受到輸血醫(yī)學及臨床工作者的重視。定義為表面抗原檢測陰性,而血清或肝臟組織中HBV DNA檢測為陽性,實為乙型肝炎病毒(HBV)的一種潛伏性感染形式,而且是輸血、器官移植、血液透析傳播乙肝病毒的重要原因。我國慢性乙型肝炎感染主要是由圍生期母嬰傳播導致,由于新生兒免疫系統尚未發(fā)育成熟,容易導致免疫耐受而產生慢性感染,隨著年齡增長發(fā)展為肝硬化、肝癌的幾率也顯著升高。不但在輸血傳播疾病中OBI廣泛受到關注,自2008年以來越來越多的各國研究人員開始關注母嬰傳播OBI的分子免疫機制。OBI可發(fā)生于乙型肝炎表面抗體／乙型肝炎核心抗體(anti-HBs/anti-HBc)陽性人群,也可發(fā)生于anti-HBs/anti-HBc陰性人群中,其檢測結果主要依賴于檢測乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B virus antigen,HBsAg)和HBV DNA試劑的靈敏度。研究表明,OBI形成最常見的原因是HBV基因變異尤其是S區(qū)及前S區(qū)變異,可影響HBV蛋白的表達,導致HBsAg陰性,或者引起抗原表位構相變化,影響抗原抗體反應,導致試劑難以檢測。導致OBI的其他原因還包括HBV其他結構區(qū)域變異,如X區(qū)變異,前C和C區(qū)變異等；另外,HBsAg分泌障礙導致大量HBsAg滯留在內質網不能分泌到胞外,從而導致HBsAg陰性的假象。再次,其他病毒感染的干擾,如HBV與其他嗜肝性病毒或者HIV重疊感染,也可相互影響導致HBV復制受到限制呈現出HBsAg陰性的感染狀態(tài)。在Pre-s/s區(qū)的任一突變都可以導致改變HBsAg的抗原性并且會抑制anti-HBs的產生。該區(qū)域的第124到147氨基酸序列包含“a”決定簇和包含應答anti-HBs顯性B細胞抗原簇。一個氨基酸在這個區(qū)域的替換突變就會間接破壞anti-HBs的循環(huán)產生,導致人群在接種乙肝疫苗后發(fā)生變異性感染,或者發(fā)生OBI。在急性乙型肝炎發(fā)生早期,HBV可自由地以免疫復合物形式存在。隨后,在HBsAg轉向anti-HBs后就轉化為免疫復合物為主,這表明血清中的HBV DNA與anti-HBs形成免疫復合物也會致使OBI的發(fā)生和發(fā)展。研究目的：本研究通過對HBsAg陽性孕婦生產的嬰幼兒進行跟蹤隨訪,以探究經乙肝疫苗主被動免疫和高效價乙肝免疫球蛋白(Hepatitis B immunoglobulin, HBIG)被動免疫以后,嬰幼兒乙型肝炎與隱匿性乙型肝炎感染的發(fā)生率及其分子免疫特征,進而為乙肝或OBI的預防、臨床發(fā)生發(fā)展和個性化治療方案提供理論指導。研究方法：本研究采集乙肝表面抗原陽性的母親及其分娩的嬰幼兒出生至少3個月以上后的血漿樣本,并在48個月內進行隨訪,第二次采集血液樣品。嬰幼兒樣本在南方醫(yī)院肝病中心使用美國雅培公司試劑盒采用化學發(fā)光法(CMIA)進行HBsAg定量( 0.05IU/ml為陰性),anti-HBs的定量 ( 10mIU/ml為陰性),HBeAg (S/CO值1為陰性)的檢測。在廈門大學國家傳染病診斷試劑與疫苗技術工程研究中心(NIDVD)采用EIA進行全部樣品的anti-HBc的定量檢測,核酸標準品來自于英國NIBSC。應用廣州達瑞公司乙型肝炎病毒e抗原時間分辨免疫熒光試劑盒對母親樣本進行HBeAg的定量。采用羅氏公司高純度核酸提取試劑盒提取血清HBV DNA核酸,根據文獻,采用高靈敏度的巢式PCR和QPCR等的方法進行HBV PreS/S、S區(qū)和BCP/PC區(qū)的擴增,擴增使用的Taq酶為Takara公司的rTaq和La-Taq酶。擴增產物經羅氏公司切膠純化回收試劑盒回收后送立菲公司進行Sanger測序,測序儀器為A.B13730。獲得序列經Seqman和MEGA6序列分析軟件進行比對和進化分析。從Genbank基因數據庫選取我國B型,C型和D型HBV野毒株全基因序列作為參考序列進行比對分析。翻譯成蛋白質進行突變分析,系統進化樹方法對所得樣本的基因型進行分型。對于有疑問的樣本進行T載體克隆并分析鑒定。應用高靈敏度的實時熒光定量(QPCR)方法對嬰幼兒和母親樣本分別進行HBV DNA定量,標準品來自于英國NIBSC,靈敏度可達5IU/ml。研究結果：1.目標人群：本研究共納入77位嬰幼兒及兒童,年齡分布3-96個月,共采集到92份樣本,其中62位只有1次隨訪抽血,15位有2次隨訪抽血。并收集到62位HBsAg日性母親的68份血漿樣本,其中56位只有1次隨訪抽血,6位是進行了2次隨訪抽血。同時還收集到6份HBsAg陽性母親的臍帶血樣品。納入的母親平均年齡28歲。本研究中涉及到的新生兒乙肝疫苗接種率為100%,疫苗接種時間為產后24小時之內,同時在與乙肝疫苗不同側臀部注射高效價乙肝免疫球蛋白(HBIG)進行被動免疫。2.血清學指標： (1)對嬰幼兒樣品檢測發(fā)現,3.9%(3/77)HBsAg陽性患兒,其余均為HBsAg陰性； 11.7%(9/77)HBeAg陽性：2.6%(2/77)HBsAg陰性/HBeAg陽性/HBV DNA陰性；5.2%(4/77)HBsAg陰性/anti-HBs陰性/anti-HBc陰性。共有14.3%(11/77)anti-HBs水平大于1000mIU/ml,其中91%(10/11)都是在出生后6個月接種第三針乙肝疫苗以后檢測的,anti-HBs在小于6個月、6-12個月、大于12個月各年齡階段中位數分別為169.8 (57.9-289.7) mIU/ml,387.7 (152.3-1301.2) mIU/ml,142.2 (49.1-498.8) mIU/ml。共有80%(74/92)嬰幼兒樣本檢測anti-HBc陽性,從6個月以后anti-HBc水平顯著下降,18個月以后普遍降至為陰性。 (2)對母親樣本檢測發(fā)現,40.3%(25/62) HBeAg陽性。 (3)對6例臍帶血檢測發(fā)現,1例HBsAg為弱陽性,有3例HBeAg陽性,anti-HBc全部陽性。3. HBV DNA檢測： (1)在89份HBsAg陰性血漿樣本中(含59份初次采集樣品和15份第二次隨訪采集樣品),其中20份樣品擴增出了BCP/PC片段,第2次隨訪樣本HBV DNA均為陰性,所有樣本Anti-HBs值均為陽性(10mIU/ml),同時有4份樣品的HBeAg值是陽性(1 S/CO)。共發(fā)現87處突變,其中3例發(fā)現A1762T/G1764A雙突變,8例發(fā)現了G1896A,但是這8例均為HBeAg陰性,同時還發(fā)現G1752A, A1846T, T1858C等處突變。(2) HBsAg陰性樣品中共有13份樣品擴增出了S片段,同樣沒有第2次隨訪血液樣本,有8例同時擴出了BCP/PC和S兩個片段。Anti-HBs值均為陽性(10mIU/ml), Anti-HBc也全部為陽性。其中3例HBeAg陽性。在S片段共發(fā)現8處氨基酸突變,分別為G45E、T139L、T47A、S53L、C76S、 Q101R, T125M和P127T,未發(fā)現重要的V39A、P41H、E64K、G145R突變。(3)92份樣本(上述89份樣品,再加3份初次隨訪HBsAg陽性樣品)中HBsAg陰性經QPCR檢測后HBV DNA陽性(病毒載量,viral load,VL 5IU/ml)的樣品共有13例,Anti-HBs也均為陽性(10 mIU/ml),且HBeAg都為陰性(1 S/CO),有4例是BCP/PC,S和VL均為陽性,其中BCP/PC或者S陽性和VL陽性的有5例。(4)6例臍帶血中有1例巢式PCR擴增S片段為陽性。 (4)S基因序列母嬰比對：對HBsAg陽性的3例嬰兒樣品進行分析,樣品B75的S片段的與其母親的比較有4個堿基不一致,分別是357位,381位,480位,636位,導致4個氨基酸變異,分別為T68I, Y76C, Q109L,Y161F。而B74和B76與其母親的HBV S片段氨基酸完全一致。通過系統進樹分析,13例HBV DNA S片段陽性樣品中B基因型10例,C基因型2例,D基因型1例。與12位母親獲得相應的HBV S序列比對發(fā)現,有6對母嬰序列高度一致并且基因型相同,但是另外6對母嬰HBV S序列與基因型不同。研究結論：對廣州市南方醫(yī)院(三甲級)HBV母嬰傳播調查顯示,母親為乙肝表面抗原陽性的新生兒出現HBsAg陽性的比率為3.9%(3/77),出現HBeAg陽性的比率為11.7%(9/77),出現HBV DNA陽性的比率為36.4%(28/77)。由于第2次48個月內隨訪采集的血液樣本中未發(fā)現HBV DNA陽性樣品,因此本研究調查中所有的HBsAg陰性,HBV DNA陽性的嬰幼兒認為是一過性OBI感染狀態(tài),未發(fā)現持續(xù)性OBI,根據OBI判定標準,其中18.2%(14/77)確定為一過性OBI。在目前的醫(yī)療新生兒24小時內聯合接種乙肝疫苗和HBIG并按計劃完成疫苗免疫可以有效阻斷96%以上HBV母嬰傳播。
【關鍵詞】：母嬰傳播 乙型肝炎病毒(HBV) 隱匿性乙型肝炎病毒感染(OBI) DNA序列
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R725.1
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-20
• 1 材料20-24
• 1.1 研究樣品20
• 1.2 主要試劑20-21
• 1.3 主要儀器21-22
• 1.4 主要溶液的配制22-23
• 1.5 引物設計23-24
• 2 方法24-36
• 2.1 血清學標志物和病毒核酸的檢測24
• 2.2 樣品病毒核酸的提取24-26
• 2.3 樣品BCP/PC、PreC/C及PreS/S、S片段的巢式PCR擴增26-30
• 2.4 PCR產物的凝膠回收30-31
• 2.5 乙肝病毒載量的測定(QPCR)31
• 2.6 HBV Pre-S/S,S PCR產物的克隆與鑒定31-33
• 2.7 OBI樣品BCP/PC、PreC/C、Pre-S/S、S片段的基因序列測定33
• 2.8 選取HBV野毒株全基因參照序列33-34
• 2.9 OBI樣品與陽性母親樣品的基因分型34-35
• 2.10 OBI樣品與參照樣品的核苷酸/氨基酸序列差異的概念35
• 2.11 軟件35-36
• 3 結果36-61
• 3.1 納入研究對象的人口學特點36-37
• 3.2 HBV血清學標志37-42
• 3.3 HBV DNA載量測定結果42-46
• 3.4 嬰幼兒血液樣品HBV BCP/PC片段擴增46-50
• 3.5 S片段的擴增50-53
• 3.6 嬰幼兒樣本HBV DNA序列與母源序列比較分析53-60
• 3.7 臍帶血BCP/PC片段和S片段的擴增60-61
• 4 討論61-67
• 4.1 乙肝疫苗及免疫球蛋白的免疫預防的規(guī)范化標準61-62
• 4.2 血清學檢測結果分析62-64
• 4.3 嬰幼兒樣品HBV DNA定量檢測結果與確認的分析64
• 4.4 嬰幼兒樣品BCP/PC擴增片段的分析64-65
• 4.5 嬰幼兒樣品S擴增片段的分析65-66
• 4.6 嬰幼兒HBV DNA擴增序列與母源序列的比對分析66-67
• 5 全文總結67-68
• 參考文獻68-75
• 綜述75-83
• 參考文獻80-83
• 縮略詞83-84
• 附錄84-90
• 發(fā)表論文90-91
• 致謝91-93

【共引文獻】

中國期刊全文數據庫 前6條

1 杜鵬;鄭欣;許曉絢;王鎮(zhèn);曾勁峰;王文敬;黎誠耀;葉賢林;;深圳地區(qū)無償獻血人群隱匿性乙型肝炎病毒感染血清學和分子生物學特征分析[J];中國輸血雜志;2014年05期

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3 韓婷婷;劉魚;李玲;劉忠;;輸血傳染性殘余風險評估方法研究進展[J];中國輸血雜志;2014年10期

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中國博士學位論文全文數據庫 前1條

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中國碩士學位論文全文數據庫 前3條

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  本文關鍵詞：嬰幼兒隱匿性乙型肝炎病毒感染的分子生物學特征分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：277547