【摘要】：NKX2.5位于人類染色體5q34,包含2個外顯子,編碼324個氨基酸,蛋白大小為35 kDa。NKX2.5蛋白具有3類保守的結構域：TN結構域、Homeodomain (HD)結構域和NK2-SD (NK2 specific)結構域。NKX2.5是心臟發(fā)育中重要的轉錄因子,在心臟的早期發(fā)育以及在成熟心臟的功能維護中起重要的作用。在小鼠模型中,E7.5時期NKX2.5在心肌發(fā)生板的內(nèi)胚層和中胚層細胞核中就開始強烈表達。NKX2.5-/-的小鼠心臟環(huán)化受阻,約在E10.5時期胚胎致死。人類NKX2.5突變引起先天性心臟病(Congenital heart disease, CHD),產(chǎn)生房間隔缺損(Aterial septal defect, ASD)、傳導系統(tǒng)異常以及形成心臟畸形等。已經(jīng)報道的NKX2.5突變有錯義突變、無義突變、插入突變和缺失突變。目前,NKX2.5基因型和先天性心臟病表型的關系仍不夠確定,NKX2.5蛋白在心臟發(fā)育中的具體分子機制還不清楚,尋找新的NKX2.5突變,研究其基因型和表型的關系以及NKX2.5突變的功能,有利于更加了解NKX2.5在心臟發(fā)育中的作用,并為尋找治療基因缺陷的方法提供可能。 在第1部分的研究中,我們收集到一個先天性心臟病家系,疾病表型為房間隔缺損、房室傳導阻滯(Atrioventricular block, AVB)、心室致密化不全(Noncompaction)、暈厥(Syncope)和猝死(Sudden death)。我們對家系樣本進行NKX2.5直接測序分析。我們發(fā)現(xiàn)了一個與疾病共分離的、全新的NKX2.5雜合2 bp插入突變,位于第2號外顯子,命名為L171RfsX5,該突變導致第171位氨基酸移碼,并在第175位氨基酸后終止。通過Swiss Model Service服務器預測,突變L171RfsX5所編碼的截短蛋白導致NKX2.5的保守HD的結構改變,缺失了HD的第二個螺旋的C端和第三個螺旋。對該突變構建真核表達質粒,轉染HeLa細胞,功能研究發(fā)現(xiàn)野生型NKX2.5蛋白定位于細胞核而突變編碼的蛋白分布于細胞核和細胞質；野生型蛋白能使ANFp-Luc的轉錄活性增強約5倍,而突變蛋白完全丟失轉錄活性。這些結果表明了L171RfsX5是一個功能性突變,這是第一次在人類NKX2.5突變中發(fā)現(xiàn)心室致密化不全表型,擴展了NKX2.5突變的表型譜。 在第2部分的研究中,我們對125例漢族散發(fā)先天性心臟病患者進行NKX2.5突變掃描分析,目的在于尋找漢族散發(fā)先天性心臟病樣本中NKX2.5的突變情況。我們發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)rs2277923 (Single nucleotide polymorphism, SNP)在病人中具有較高的頻率,與105例對照樣本相比,小等位基因A的頻率顯著(P=0.04),顯示NKX2.5 SNPrs2277923可能與漢族先天性心臟病的發(fā)生相關,還需要加大樣本分析。功能研究表明SNP rs2277923 (63ag)編碼的蛋白定位于細胞核,和野生型相比約降低20%的轉錄活性。 在第3部分的研究中,我們對8個已經(jīng)報道的NKX2.5無義突變進行結構和功能分析和氨基糖苷類抗生素誘導無義突變的通讀實驗。首先構建NKX2.5無義突變在pcDNA3.1載體上的表達質粒(pE109X, pQ149X, pQ170X, pQ187X, pQ198X, pY256X,pY259X和pC264X)和3個突變(E109X, Q149X和C264X)在pEGFP-N1上的融合蛋白表達質粒NKX2.5mut-EGFP。在HeLa細胞中對KX2.5的8個突變進行免疫熒光定位分析和雙報告熒光素酶系統(tǒng)的轉錄活性檢測。結果表明pQ198X, pY256X, pY259X能使ANFp-Luc的轉錄活性增加約2倍,pC264X和pWT-NKX2.5能使ANFp-Luc的轉錄活性增加4-5倍,而pE109X, pQ149X, pQ170X, pQ187X完全沒有轉錄活性。pWT-NKX2.5, pQ198X, pY256X, pY259X和pC264X定位于細胞核,而pE109X,pQ149X, pQ170X, pQ187X的定位發(fā)生改變。接下來進行通讀的定性試驗,在HeLa細胞中轉染突變的NKX2.5-EGFP分別加入氨基糖苷類抗生素慶大霉素(gentamicin)和G418,孵育48-72 h,熒光顯微鏡下觀察EGFP的強度,判斷無義突變是否有通讀以及藥物的工作濃度。然后,選擇合適的藥物濃度對8個無義突變質粒誘導通讀,并通過檢測誘導后轉錄活性的變化來估算通讀效率。結構-功能的結果表明NKX2.5蛋白的C端對于其轉錄活性很重要；HD區(qū)域內(nèi)的一段R/K富集的序列(Q187NRRYKCKRQR197)對于NKX2.5蛋白的正確定位是必須的。通讀實驗結果表明gentamicin和G418均能誘導8個NKX2.5無義突變通讀,并且通讀效率最高可達到13.8%和32.2%。該結果為攜帶NKX2.5無義突變的先天性心臟病病人的基因治療提供了潛在的可能性。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R725.4

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本文編號：2774045