發(fā)布時(shí)間：2020-07-29 13:48

【摘要】：NKX2.5位于人類染色體5q34,包含2個(gè)外顯子,編碼324個(gè)氨基酸,蛋白大小為35 kDa。NKX2.5蛋白具有3類保守的結(jié)構(gòu)域：TN結(jié)構(gòu)域、Homeodomain (HD)結(jié)構(gòu)域和NK2-SD (NK2 specific)結(jié)構(gòu)域。NKX2.5是心臟發(fā)育中重要的轉(zhuǎn)錄因子,在心臟的早期發(fā)育以及在成熟心臟的功能維護(hù)中起重要的作用。在小鼠模型中,E7.5時(shí)期NKX2.5在心肌發(fā)生板的內(nèi)胚層和中胚層細(xì)胞核中就開始強(qiáng)烈表達(dá)。NKX2.5-/-的小鼠心臟環(huán)化受阻,約在E10.5時(shí)期胚胎致死。人類NKX2.5突變引起先天性心臟病(Congenital heart disease, CHD),產(chǎn)生房間隔缺損(Aterial septal defect, ASD)、傳導(dǎo)系統(tǒng)異常以及形成心臟畸形等。已經(jīng)報(bào)道的NKX2.5突變有錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、插入突變和缺失突變。目前,NKX2.5基因型和先天性心臟病表型的關(guān)系仍不夠確定,NKX2.5蛋白在心臟發(fā)育中的具體分子機(jī)制還不清楚,尋找新的NKX2.5突變,研究其基因型和表型的關(guān)系以及NKX2.5突變的功能,有利于更加了解NKX2.5在心臟發(fā)育中的作用,并為尋找治療基因缺陷的方法提供可能。 在第1部分的研究中,我們收集到一個(gè)先天性心臟病家系,疾病表型為房間隔缺損、房室傳導(dǎo)阻滯(Atrioventricular block, AVB)、心室致密化不全(Noncompaction)、暈厥(Syncope)和猝死(Sudden death)。我們對(duì)家系樣本進(jìn)行NKX2.5直接測(cè)序分析。我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與疾病共分離的、全新的NKX2.5雜合2 bp插入突變,位于第2號(hào)外顯子,命名為L(zhǎng)171RfsX5,該突變導(dǎo)致第171位氨基酸移碼,并在第175位氨基酸后終止。通過(guò)Swiss Model Service服務(wù)器預(yù)測(cè),突變L171RfsX5所編碼的截短蛋白導(dǎo)致NKX2.5的保守HD的結(jié)構(gòu)改變,缺失了HD的第二個(gè)螺旋的C端和第三個(gè)螺旋。對(duì)該突變構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,功能研究發(fā)現(xiàn)野生型NKX2.5蛋白定位于細(xì)胞核而突變編碼的蛋白分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)；野生型蛋白能使ANFp-Luc的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)約5倍,而突變蛋白完全丟失轉(zhuǎn)錄活性。這些結(jié)果表明了L171RfsX5是一個(gè)功能性突變,這是第一次在人類NKX2.5突變中發(fā)現(xiàn)心室致密化不全表型,擴(kuò)展了NKX2.5突變的表型譜。 在第2部分的研究中,我們對(duì)125例漢族散發(fā)先天性心臟病患者進(jìn)行NKX2.5突變掃描分析,目的在于尋找漢族散發(fā)先天性心臟病樣本中NKX2.5的突變情況。我們發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)rs2277923 (Single nucleotide polymorphism, SNP)在病人中具有較高的頻率,與105例對(duì)照樣本相比,小等位基因A的頻率顯著(P=0.04),顯示NKX2.5 SNPrs2277923可能與漢族先天性心臟病的發(fā)生相關(guān),還需要加大樣本分析。功能研究表明SNP rs2277923 (63ag)編碼的蛋白定位于細(xì)胞核,和野生型相比約降低20%的轉(zhuǎn)錄活性。 在第3部分的研究中,我們對(duì)8個(gè)已經(jīng)報(bào)道的NKX2.5無(wú)義突變進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析和氨基糖苷類抗生素誘導(dǎo)無(wú)義突變的通讀實(shí)驗(yàn)。首先構(gòu)建NKX2.5無(wú)義突變?cè)趐cDNA3.1載體上的表達(dá)質(zhì)粒(pE109X, pQ149X, pQ170X, pQ187X, pQ198X, pY256X,pY259X和pC264X)和3個(gè)突變(E109X, Q149X和C264X)在pEGFP-N1上的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒NKX2.5mut-EGFP。在HeLa細(xì)胞中對(duì)KX2.5的8個(gè)突變進(jìn)行免疫熒光定位分析和雙報(bào)告熒光素酶系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)。結(jié)果表明pQ198X, pY256X, pY259X能使ANFp-Luc的轉(zhuǎn)錄活性增加約2倍,pC264X和pWT-NKX2.5能使ANFp-Luc的轉(zhuǎn)錄活性增加4-5倍,而pE109X, pQ149X, pQ170X, pQ187X完全沒有轉(zhuǎn)錄活性。pWT-NKX2.5, pQ198X, pY256X, pY259X和pC264X定位于細(xì)胞核,而pE109X,pQ149X, pQ170X, pQ187X的定位發(fā)生改變。接下來(lái)進(jìn)行通讀的定性試驗(yàn),在HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染突變的NKX2.5-EGFP分別加入氨基糖苷類抗生素慶大霉素(gentamicin)和G418,孵育48-72 h,熒光顯微鏡下觀察EGFP的強(qiáng)度,判斷無(wú)義突變是否有通讀以及藥物的工作濃度。然后,選擇合適的藥物濃度對(duì)8個(gè)無(wú)義突變質(zhì)粒誘導(dǎo)通讀,并通過(guò)檢測(cè)誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)錄活性的變化來(lái)估算通讀效率。結(jié)構(gòu)-功能的結(jié)果表明NKX2.5蛋白的C端對(duì)于其轉(zhuǎn)錄活性很重要；HD區(qū)域內(nèi)的一段R/K富集的序列(Q187NRRYKCKRQR197)對(duì)于NKX2.5蛋白的正確定位是必須的。通讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明gentamicin和G418均能誘導(dǎo)8個(gè)NKX2.5無(wú)義突變通讀,并且通讀效率最高可達(dá)到13.8%和32.2%。該結(jié)果為攜帶NKX2.5無(wú)義突變的先天性心臟病病人的基因治療提供了潛在的可能性。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R725.4

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本文編號(hào)：2774045