【摘要】： 幼年特發(fā)性關節(jié)炎(juvenile idiopathic arthritis，JIA)是一組由多因素誘導的自身免疫性慢性結締組織綜合癥。它涵蓋以往的幼年類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，JRA)和幼年慢性關節(jié)炎。其并發(fā)癥和后遺癥是兒童后天致殘的主要原因之一。其病因至今不明，主要認為是由于感染、遺傳、環(huán)境、內(nèi)分泌、神經(jīng)調(diào)節(jié)等因素引起機體免疫紊亂而形成反復慢性炎癥所致。治療十分棘手，因此，對其發(fā)生機制的探討和尋找合理有效的治療途徑十分重要。 樹突狀細胞(dendritic cell，DC)作為專職抗原提呈細胞(antigenpresenting cell，APC)，抗原提呈能力獨特，在免疫應答啟動、調(diào)節(jié)和效應等各個環(huán)節(jié)，均發(fā)揮關鍵性的作用。因此，最近DC在慢性感染、自身免疫病和腫瘤等一系列疾病中所發(fā)揮的作用備受重視。 最近研究表明，膽堿能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway)是機體重要的抗炎機制之一。免疫細胞如T淋巴細胞和巨噬細胞存在固有膽堿能系統(tǒng)，是膽堿能系統(tǒng)抗炎通路的重要組成部分。免疫細胞膽堿能物質(zhì)可能是免疫系統(tǒng)與神經(jīng)系統(tǒng)聯(lián)系的物質(zhì)基礎，兩者吻合的關鍵分子之一是煙堿樣乙酰膽堿能受體(nicotineic acetylcholinergic receptor，nAChR)。該通路出現(xiàn)異常，會導致全身性炎癥反應，如引起類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)等自身免疫病的的發(fā)生，而刺激小鼠迷走神經(jīng)可減輕全身炎性反應。最近有學者提出RA可能與迷走神經(jīng)功能缺陷有關，本實驗室前期工作已表明膠原性關節(jié)炎與機體的固有膽堿能系統(tǒng)物質(zhì)表達降低有關。白三烯B4(leukotriene B4，LTB4)與白三烯B4受體(leukotriene B4 receptor，BLT)信號通路LTB4-BLT(包括LTB4-BLT1和LTB4-BLT2)參與機體的炎癥病理反應。它是機體炎癥反應的早期“預警信號”(alarm signal)，在機體炎癥早期免疫放大中起關鍵作用。有人提出在RA發(fā)病中LTB4-BLT2信號通路可能比LTB4-BLT1發(fā)揮更大作用。 樹突狀細胞(DC)作為抗原提呈功能最強的APC，是否存在固有膽堿能系統(tǒng)和LTB4-BLT信號通路，它們在炎癥免疫中發(fā)揮怎樣的作用?尚無系統(tǒng)研究。因此，探討DC的固有膽堿能系統(tǒng)，以及與LTB4-BLT信號通路的關系，對于探討JIA等一類風濕性自身免疫病的炎癥機制及其治療策略可能有重要意義。 本研究旨在探討DC是否具有膽堿能系統(tǒng)成分(nAChRα7、ChAT和AChE)和LTB4-BLT信號通路物質(zhì)，以及膽堿能系統(tǒng)和LTB4-BLT2信號通路在JIA炎癥反應中的作用。全文分三部分，結果簡述如下。 第一部分小鼠骨髓來源樹突狀細胞的體外誘導培養(yǎng) 目的： DC獲取困難。旨在建立小鼠骨髓前體細胞分離培養(yǎng)DC的方法。優(yōu)化條件，克服影響DC誘導、分化、成熟和消化的相關因素，并在細胞形態(tài)、表面標志分子及分泌細胞因子方面予以鑒定。 方法： 1．無菌分離正常BALB／c小鼠骨髓細胞，體外用細胞因子包括重組小鼠白細胞介素-4(interleukin-4，rmIL-4)和重組粒細胞巨噬細胞-集落刺激因子(recombinate mouse granulocyte-colony stimulating factor，rmGM-CSF)誘導、分化為幼稚DC，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激獲取成熟DC。 2．光學顯微鏡觀察DC形態(tài)變化。 3．采用新鮮配制0.4％胰酶37℃消化細胞。 4．流式細胞術檢測DC標志分子。 5．ELISA方法檢測幼稚和成熟DC培養(yǎng)上清中白細胞介素-12(interleukin-12，IL-12)含量。 結果： 1．純化后獲取的骨髓細胞與rmIL-4及rmGM-CSF共同培養(yǎng)4h即可看到細胞貼壁，2d可看到少許細胞突起，細胞體積逐漸長大，3d后細胞形狀不規(guī)則且毛刺狀突起增多，逐漸增長，呈幼稚狀態(tài)DC的形態(tài)學改變。培養(yǎng)到6d，加入LPS 24h-48h后，細胞分化程度更高，呈現(xiàn)成熟狀態(tài)DC的典型樹突改變。同時，觀察到具有樹突形狀的細胞數(shù)占細胞總數(shù)的平均數(shù)為85％—90％。 2．DC相對特異標志分子CD_(11)c、主要組織相容性復合分子MHC—Ⅱ、共刺激分子CD80和CD86于DC成熟前后表達率(％)分別為41.783±6.106、32.300±4.586、21.683±2.875、27.523±3.708和75.687±11.671、71.767±9.199、63.293±8.119、71.970±10.485。表明隨DC的成熟，其表面標志分子表達明顯增多，成熟狀態(tài)與幼稚狀態(tài)比較(p＜0.01)。 3．幼稚和成熟DC培養(yǎng)上清中IL-12含量分別為37.7±7.6pg／ml和712±134.425pg／ml，成熟DC培養(yǎng)上清IL-12含量比幼稚DC明顯升高(p＜0.01)。 小結： 優(yōu)化條件建立體外用rmGM-CSF和rmIL-4定向誘導以及LPS刺激小鼠骨髓細胞培養(yǎng)DC的方法。該方法能成功培養(yǎng)出具備幼稚和成熟功能的DC。該方法誘導細胞分化率高、生長穩(wěn)定、細胞功能完好，是本課題深入研究的技術基礎。 第二部分DC固有膽堿能系統(tǒng)和LTB4-BLT信號通路表達 一、成熟DC膽堿能系統(tǒng)表達以及MEC對nAChRα7表達的影響 目的： 探討成熟DC是否存固有膽堿能系統(tǒng)及其調(diào)控機制。 方法： 1．免疫細胞化學方法和免疫熒光抗體技術檢測成熟DC膽堿能系統(tǒng)(nAChRα7、ChAT和AChE)蛋白的定位表達。 2．流式細胞術分析成熟DC膽堿能系統(tǒng)(nAChRα7、ChAT和AChE)蛋白的定量表達。 3．RT-PCR方法檢測成熟DC膽堿能系統(tǒng)(nAChRα7、ChAT和AChE)mRNA表達。 4．流式細胞儀檢測非特異性阻斷劑美加明(mecamylamine，MEC)作用于成熟DC 12h對nAChRα7表達的影響。 結果： 1．成熟DC nAChRα7蛋白主要分布于細胞膜，ChAT和AChE主要分布于細胞漿。nAChRα7、ChAT及AChE蛋白表達率(％)分別為41.267±3.470、37.467±4.441和49.867±5.620，三者表達水平比較，AChE表達最強，與ChAT比較(p＜0.05)，與nAChRα7比較有上升趨勢。 2．成熟狀態(tài)DC均有nAChRα7、ChAT和AChE mRNA表達。 3．MEC作用12h后DC nAChRα7表達率(％)為20.651±4.374，MEC能明顯抑制nAChRα7表達，與無MEC組比較(p＜0.05)。 小結： 1．成熟DC存在固有膽堿能系統(tǒng)組成成分(nAChRα7、ChAT和AChE)。nAChRα7主要存在于DC細胞膜，而ChAT和AChE主要存在于細胞漿。DC固有膽堿能系統(tǒng)可能與炎癥免疫調(diào)節(jié)功能有關。 2．外源藥物(如MEC等)可改變固有膽堿能系統(tǒng)功能狀態(tài)。 二、DC LTB4-BLT信號通路表達 目的： 探討DC白三烯B4(leukotriene B4，LTB4)—白三烯B4受體(leukotriene B4 receptor，BLT)信號通路(LTB4-BLT包括LTB4-BLT1和LTB4-BLT2)存在狀態(tài)。 方法： 1．ELISA方法檢測幼稚、成熟DC培養(yǎng)上清中LTB4含量。 2．免疫細胞化學方法和免疫熒光抗體方法檢測成熟DC BLT2蛋白定位表 3．RT-PCR方法檢測幼稚和成熟DC BLT mRNA表達。 結果： 1．于2、4和6d(幼稚狀態(tài))和8d(LPS刺激后成熟狀態(tài))，DC培養(yǎng)上清中LTB4含量分別為10.667±2.394pg／ml、7.089±1.810pg／ml、3.222±0.995pg／ml和14.217±3.396pg／ml，隨DC分化進行，其培養(yǎng)上清中LTB4含量呈遞減趨勢。成熟DC較幼稚DC分泌LTB4含量明顯增高(p＜0.05) 2．成熟DC胞膜和胞漿均表達BLT2，以胞槳特別是細胞器表達最強。 3．RT—PCR顯示成熟狀態(tài)和稚狀態(tài)DC均表達BLT1和BLT2 mRNA，且成熟DC表達水平較幼稚狀態(tài)DC明顯增強(p＜0.05)。 小結： 1．DC可通過分泌LTB4和表達BLT而建立自身LTB4-BLT信號通路。 2．成熟DC LTB4-BLT1和LTB4-BLT2信號通路表達較幼稚DC增強，成熟DC胞膜和胞漿均表達BLT2，以胞槳特別是細胞器表達最強。該信號通路可能參與了DC分化、成熟過程。 3．DC可能通過上述LTB4-BLT1和LTB4-BLT2兩條信號通路在炎癥反應中發(fā)揮重要作用。 第三部分DC固有膽堿能系統(tǒng)和LTB4-BLT2信號通路在JIA炎癥反應中的作用 目的： 探討DC固有膽堿能系統(tǒng)和LTB4-BLT2信號通路在JIA炎癥反應中的作用。 方法： 1．流式細胞儀檢測正常血清組、JIA活動期血清組和JIA活動期血清+美加明(MEC)組對DC nAChRα7、BLT2表達的影響； 2．ELISA方法檢測正常血清組、JIA活動期血清組和JIA活動期血清+MEC組作用DC 18h前后，培養(yǎng)上清中IL-12和LTB4含量； 3．流式細胞術檢測正常血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組、JIA活動期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組、MEC干預的JIA活動期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組對小鼠脾淋巴細胞活化(CD69表達)的影響； 4．MTT法檢測正常血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組、JIA活動期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組、MEC干預的JIA活動期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響； 結果 1．正常血清組、JIA活動期血清組和JIA活動期血清+美加明(MEC)組作用成熟DC 18h后DC nAChRα7表達率(％)分別為：39.80±4.12、52.66±7.99和45.49±7.73。JIA活動期血清組與正常血清組比較，nAChRα7表達明顯增強(p＜0.05)，而美加明(MEC)作用后，nAChRα7表達下調(diào)。 2．正常血清組、JIA活動期血清組和JIA活動期血清+美加明(MEC)組作用成熟DC 18h后BLT2表達率(％)分別為：27.57±2.989，45.947±8.068和67.343±11.394。JIA活動期血清組與正常血清組比較，BLT2表達增強(p＜0.05)；MEC作用后，BLT2表達更顯著(p＜0.01)。 3．正常血清組、JIA活動期血清組、JIA活動期血清+MEC組分別作用DC 18h前后，DC培養(yǎng)上清中IL-12、LTB4含量與DC作用前，檢測實際為血清中細胞因子的含量。 1)與DC作用前，JIA活動期血清組和正常血清組IL-12含量分別為975.525±206.638pg／ml和23.823±3.555pg／ml，JIA活動期血清組比正常血清組IL-12含量明顯增高(p＜0.01)；培養(yǎng)18h后，正常血清組、JIA活動期血清組和JIA活動期血清+MEC組IL-12含量分別為48.893±9.562pg／ml、1281.175±228.586pg／ml、1618.075±292.81pg／ml，與正常血清組比較增高明顯(p＜0.01)。而JIA活動期血清組+MEC組比JIA活動期血清組IL-12含量亦有升高(p＜0.05)；同時，JIA活動期血清組IL-12表達量在DC作用后比作用前亦增強(p＜0.05)。 2) JIA活動期血清組和正常血清組LTB4含量分別為82.375±19.9pg／ml和16.9±2.953pg／ml，JIA活動期血清組與正常血清組比較明顯增高(p＜0.01)；18h后，正常血清組、JIA活動期血清組和JIA活動期血清+MEC組LTB4含量分別為24.225±6.264pg／ml、114.575±20.375pg／ml和142.05±24.574pg／ml。JIA活動期血清組、JIA活動期血清+MEC組LTB4表達量比正常血清組增高明顯(p＜0.01)。同時，JIA活動期血清+MEC組LTB4含量比JIA活動期血清組亦增高(p＜0.05)；JIA活動期血清組與作用18h前比較，LTB4含量的增高亦有差異性(p＜0.05)。 4．正常血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組、JIA活動期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組、MEC干預的JIA活動期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組聯(lián)合小劑量刀豆蛋白(Concanvalin A ConA)體外刺激淋巴細胞8h，CD69表達率(％)分別為：3.4±0.683、34.35±5.17、43.35±7.12。JIA活動期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組、MEC干預的JIA活動期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組比正常血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組CD69表達水平顯著增高(p＜0.01)。同時，MEC干預的JIA活動期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組與無MEC干預的JIA活動期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組比較，CD69亦增高(p＜0.05)。 5．正常血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組、JIA活動期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組、MEC干預的JIA活動期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組聯(lián)合小劑量ConA對小鼠脾淋巴細胞增殖結果(SI值)分別是：1.979±0.307、3.053±0.432、3.672±0.817。MEC干預的JIA活動期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組增殖作用最強，與JIA活動期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組比較(p＜0.05)。與正常血清刺激的DC條件培養(yǎng)液組比較增殖作用顯著(p＜0.01)。 小結： 1．JIA活動期血清能刺激DC，使nAChRα7和BLT2表達上調(diào)，MEC則下調(diào)nAChRα7表達，抑制膽堿能系統(tǒng)的抗炎作用。 2．DC固有膽堿能系統(tǒng)功能抑制，可引起LTB4-BLT2信號通路活化，加強炎癥反應。 3．DC膽堿能系統(tǒng)功能抑制，可促進IL-12和LTB4等炎性因子分泌而增強炎癥反應。 DC固有膽堿能系統(tǒng)調(diào)節(jié)紊亂以及LTB4-BLT2信號通路活化所致的炎癥放大反應和免疫細胞過渡活化可能參與了JIA的炎癥病理過程。 總結 1．DC存在固有膽堿能系統(tǒng)成分(nAChRα7、ChAT和AChE)以及LTB4-BLT信號通路。 2．JIA活動期血清能增強DC nAChRα7和LTB4-BLT2表達，MEC能抑制nAChRα7表達，增強LTB4-BLT2表達，并引起DC致炎因子(LTB4，IL-12)分泌升高。提示：DC固有膽堿能系統(tǒng)功能失調(diào)和LTB4-BLT2信號通路活化可能參與了JIA炎癥病理過程。 3．JIA活動期血清刺激的DC條件培養(yǎng)液明顯促進淋巴細胞活化(CD69表達)、增殖。MEC干預后，上述作用更顯著。提示：DC及其固有膽堿能系統(tǒng)參與了淋巴細胞的增殖活化調(diào)控，該作用失調(diào)，會造成免疫細胞的異常活化。 結論：DC膽堿能系統(tǒng)功能抑制和LTB4-BLT2信號通路活化可能參與了JIA發(fā)病的炎癥過程。通過激活DC膽堿能系統(tǒng)和阻斷LTB4-BLT2信號通路可能是控制JIA等自身免疫病的有效途徑。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R725.9
【圖文】：

華中科技大學同濟醫(yī)學院博士研究生畢業(yè)論文圖1一loc形態(tài)學改變樹突形狀的幼稚DC(6d)(xZOO)圖1一Zoc形態(tài)學改變典型樹突形狀的成熟DC(8d)(xZOO)二、流式細胞儀分析DC表面標志分子CDI:e、MHC一11及CD80、CD86表達DC相對特異標志分子CD，，c、組織相容性復合分子MHC一n、共刺激分子CD80(B7一1)和CD86(B7一2)隨DC(P(0.01)。(表1一1和圖1一3，的成熟表達明顯增多，成熟狀態(tài)與幼稚狀態(tài)比較1一4)。表1一1幼稚和成熟 DCCDlle、MHC一11、CD80和CD86表達百分數(shù)(%)(x士s，n=3)表型分子幼稚DC成熟DC CDllC41.783士6.10675.687土 11.671*申MHC一11767士9.199.今…電‘上Q口11

本文編號：2773398